Подсчет числа клеток в 1 мл ночной культуры e.Coli с помощью метода серийных разведений и посева клеток на чашки Петри. Определение зависимости od600 от количества клеток.
После проведения действий, описанных в методичке к лабораторной работе, через некоторое время к нам на почту пришли результаты посева культуры в чашки Петри в виде фотографий. Вот они:
К
сожалению, даже уже на шестой чашке
посч
итать
сколько-нибудь точное количество колоний
становится проблематично, потому мы
посчитали количество отдельных колоний
(а следовательно, породивших их клеток)
с первой по пятую чашки.
Заметим, что на чашки Петри мы наносили раствор в объеме 0,1 мл. Результаты в таблице - это пересчитанное на 1 мл количество клеток (то есть, мы посчитали количество колоний на картинке и умножили его на 10).
Номер чашки |
Количество колоний (клеток) |
1 |
20 |
2 |
60 |
3 |
400 |
4 |
510 |
5 |
2400 |
В ходе выполнения предыдущей работы мы поняли, что метод серийных разведений хорош в том числе тем, что дает рекуррентное соотношение для весовых концентраций. В нашем случае, вначале в лунках было по 900 мкл чистой среды, а переливали мы по 100 мкл раствора клеток. Пользуясь методикой расчета из предыдущей части, мы можем посчитать, что коэффицент будет составлять 0,1, то есть весовые концентрации клеток относятся как:
Ni = (0.1)*N(i-1)
Далее посчитаем, сколько мл клеток было в каждой из чашек, для которых мы знаем количество клеток. Затем мы поделим количество клеток на эти самые объемы, усредним полученные 4 числа и получим примерное количество клеток на 1 мл.
Начинали мы с 1 мл культуры в пробирке №12. Следовательно, в пробирке №11 (которую использовали для посева на чашку №11) находилось 0.1 мл клеток. В десятой - 0.01 мл клеток и так далее. Нетрудно видеть, что для пробирки с номером i объем клеток в ней будет составлять:
Vi = 10^(i-12) (в миллилитрах)
V1 = 10^-11 мл
V2 = 10^-10 мл
V3 = 10^-9 мл
V4 = 10^-8 мл
V5 = 10^-7 мл
Получим число клеток в 1 мл ночной культуры, поскольку у нас есть все необходимые данные. При этом исключим из подсчета чашку номер 1, так как в силу малой концентрации, погрешность для нее слишком велика и скорее лишь испортит нашу величину.
x = (60*10^10 + 400*10^9 + 510*10^8 + 2400*10^7)/4 = 10^7(2400+5100+40000+60000)/4 = 26875 * 10^7 (клеток/мл)
Ответ к заданию 1: 26875 * 10^7 клеток/мл
Обратим внимание на то, что количество клеток, посчитанное нами по виду чашек Петри, вовсе не находится в последовательном отношении с коэффициентом 0.1. Среднее значение коэффициента разведения равняется:
(20/60 + 60/400 + 400/510 + 510/2400) / 4 = 0.37
Такого
рода различие можно объяснить неточностью
сведений в первой чашке Петри (в силу,
повторимся, малого количества клеток
в целом), а также многочисленными
факторами, которые влияли на ход
эксперимента и увеличивали погрешность
(по-разному взболтанный материал в
пробирках, кто-то брал самплером материал
со дна пробирки, кто-то не совсем со дна,
недостаточно охлажденный шпатель и
прочее).
В задании 2 требуется построить график зависимости оптической плотности OD600 от количества клеток. Вот данные, выданные спектрофотометром.
Absorbance - это то же самое, что optical density, то есть как раз оптическая плотность. Видим, что она имеет существенно отличное от нуля значение только для пробирок номер 9,10,11. Вычислим количество клеток в этих пробирках и посторим график по имеющимся трем точкам. Обратим внимание на то, что в наших пробирках находился раствор в объеме 1 мл, но мы меряли оптическую плотность после нанесения на чашки Петри 100 мкл раствора (то есть, в пробирках оставалось 0,9 мл раствора).
Зная это, а также коээфициент разведения и то, сколько клеток было в 1 мл из прошлого задания можем получить таблицу следующую таблицу:
Номер пробирки |
Количество клеток |
Оптическая плотность |
9 |
24187*10^4 |
0,127 |
10 |
24187*10^5 |
0,605 |
11 |
24187*10^6 |
2,049 |
Таким образом, теперь мы имеем все необходимые данные для построения графика. Предполагая, что зависимость линейная, по имеющимся трем точкам построим прямую.
Обратим внимание на то, что масштаб оси, на которой указано количество клеток, уменьшен в 10000 раз.