1.2. Детекторы в газовой хроматографии
Кроме выбора неподвижной фазы для определения вещества важен выбор детектора. На практике в ГХ используют:
Катарометр – универсальный детектор с невысокой чувствительностью;
Пламенно-ионизационный детектор, позволяющий определять горючие вещества в воздушно-водородной смеси. Обладает высокой чувствительностью, особенно к углеводородам. Наличие в структуре вещества атомов галогенов, кислорода, азота, серы осложняет ионизацию молекул и уменьшает чувствительность.
Электроно-захватный детектор – это селективный детектор по отношению к веществам, в структуре которых есть элементы с высокой электроотрицательностью. Максимальную чувствительность детектор проявляет к галогенированным углеводородам.
Масс-спектрометрический детектор – универсальный, высокочувствительный, позволяет идентифицировать вещества с высокой надежностью и определять структуру неизвестных соединений. При использовании этого детектора помимо хроматограммы смеси можно зарегистрировать масс-спектр соединения во время фиксирования его хроматографического пика.
2. Закономерности удерживания в жидкостной хроматографии
2.1. Разделение веществ с высокой молекулярной массой
Вещества с высокой молекулярной массой (более 3000) разделяют эксклюзионной и гель-проникающей хроматографией. Разделение основано на ограниченном проникновении (или невозможности проникновения) молекул в поры сорбента. В зависимости от размера молекул (в растворе) они будут в большей или меньшей степени «исключаться» из пор сорбента, что в результате повлияет на их время удерживания.
2.1. Разделение веществ высокоэффективной жидкостной хроматографией
Для относительно небольших молекул используют различные варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ): нормально-фазовую (НФ), обращено-фазовую (ОФ ), ион-парную (ИП) и ионную (ИХ). Основное отличие этих вариантов хроматографии от ранее рассмотренных в том, что подвижная фаза активно участвует в распределении вещества между фазами. Исследователь должен решить, какой вариант лучше для решения поставленной задачи, т.е выбрать оптимальное сочетание сорбента того или иного химического класса и подвижной фазы на основании водных или органических растворителей, в определенном интервале рН, наличием специфических добавок кислого, основного или поверхностно-активного характера и т.д. При выборе метода учитывают ионное состояние, полярность определяемого вещества, его растворимость в различных по природе растворителях и кислотно-основные свойства. Главным условием является растворимость соединения в подвижной фазе.
2.2. Нормально-фазовая и обращено-фазовая вэжх
Для неионизированных соединений, или ионизация которых может быть легко подавлена, используют НФ и ОФ ВЭЖХ. В этих методах удерживание и разделение веществ зависит от их полярности. Оценка полярности вещества сложная задача. На практике достаточно удобной является условная оценка полярности, основанная на шкале упрощенного критерия гидрофобности Н. Эта характеристика вещества учитывает относительное количество полярных и неполярных структурных фрагментов, содержащихся в молекуле, и может быть оценена по формуле:
Н = nН -4 √nf,
где nН - суммарное число атомов углерода и галогенов, nf - число функциональных групп в молекуле вещества.
Чем больше Н, тем меньше полярность, выше гидрофобность (водоотталкивание).
В НФ ВЭЖХ подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная (силикагель, оксид алюминия, силикагель с привитыми полярными группами). Основной механизм удерживания – адсорбционный. Удерживание соединений происходит за счёт диполь-дипольных взаимодействий между полярными группами соединения и активных центров (тоже полярных) на поверхности адсорбента. Подвижной фазой обычно служит н-гексан с добавками более полярных растворителей: спиртов, хлороформа, хлористого метилена, толуола, эфиров (этилацетат). Чем полярнее молекула, тем больше ее сродство к неподвижной фазе и время удерживания. Порядок элюирования некоторых соединений показан на рис.1. Для уменьшения времени удерживания вещества в подвижную фазу вводят более полярные растворители и увеличивают их содержание.
Например, при разделении бензола, нафталина и антрацена при элюировании подвижными фазами 5 и 10 % изопропанола время удерживания соединений во втором случае будет меньше.
Рис. 1. Ряды элюирования в нормально-фазовой ВЭЖХ.
В ОФ ВЭЖХ неподвижная фаза – неполярна (обычно силикагель с привитыми углеводородными радикалами), а подвижная фаза – более полярна. Основной механизм распределительный (между подвижной фазой и «псевдожидкой» фазой на поверхности модифицированного силикагеля) Удерживание соединений происходит за счёт гидрофобных взаимодействий между молекулами вещества и углеводородными «хвостами» на поверхности модифицированного силикагеля
В качестве подвижной фазы используют смеси полярных органических растворителей (ацетонитрила, метанола, изо-пропанола) с водой. Чем гидрофобнее (менее полярна) молекула, тем больше ее сродство к неподвижной фазе и время удерживания. Эту закономерность иллюстрируют ряды элюивания, приведенные на рис.2.
Рис.2. Ряды элюирования соединений в обращено-фазовой ВЭЖХ
Для уменьшения времени удерживания вещества повышают элюирующую способность подвижной фазы, для чего вводят органические растворители (они менее полярны, чем вода) и увеличивают их содержание. На рис.3 показано, что при уменьшении содержания ацетонитрила в подвижной фазе время удерживания разделяемых соединений растет, увеличивается и различия в удерживании (селективность).
Рис.3. Удерживание веществ в ОФ ВЭЖХ в зависимости от соотношения ацетонитрил-вода в подвижной фазе
На время удерживания веществ влияет природа неподвижной фазы. При увеличении размера углеводородных радикалов, химически привитых на поверхность силикагеля, увеличивается гидрофобность сорбента, и неполярные вещества удерживаются сильнее (рис. 4).
Рис.4. Зависимость удерживания веществ в ОФ ВЭЖХ от длины привитого радикала на поверхности силикагеля
Следует отметить, что многие органические вещества со средней полярностью можно разделять как НФ ВЭЖХ, так и ОФ ВЭЖХ. Силикагель (НФХ) селективнее при разделении изомеров (о, м, п), а также сорбатов, различающихся по функциональности (производные бензола, фенола и т.д.). При разделении гомологов (пентан - декан) спиртов, кислот лучше применять алкилсиликагели (ОФХ). Если в анализируемой смеси предполагаются компоненты разной химической природы: витамины, лекарства, наркотики, токсины, гормоны начинать разработку метода лучше с ОФ ВЭЖХ.