Обмен веществ у микроорганизмов отличается чрезвычайным раз­нообразием. Это связано со способностью микроорганизмов использо­вать для обмена веществ широкий круг органических и минеральных соединений. Такая способность обусловливается наличием у микроор­ганизмов большого разнообразия ферментов. На активность ферментов влияют температура, рН и другие факторы внешней среды - воздействие химических веществ среды, лучистая энергия и др. Физиологические процессы, протекающие в клетках микроорганизмов, почти полностью зависят от активности ферментов, поэтому любой фактор, действующий на фермент, будет воздействовать и на метаболизм микроорганизмов.

Каждому виду микроорганизмов свойственен определенный набор ферментов, постоянно присутствующих в клетке (т.н. конститутивные ферменты). В то же время некоторые ферменты синтезируются клеткой только тогда, когда в среде появляется соответствующий субстрат. Такие ферменты называют индуктивными.

По характеру действия ферменты подразделяются на экзоферменты, выделяемые клеткой в окружающую среду, и эндоферменты. прочно связанные с клеточными структурами (митохондриями, цитоплазматической мембраной и мезосомами) и действуют внутри клетки. И те, и другие играют важную роль в обмене веществ микроорганизмов. Экзоферменты (обычно гидролазы) катализируют реакции вне клетки. К эндоферментам относятся оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные ферменты), трансферазы (ферменты переноса) и др., играющие важную роль в энергетическом обмене.

Конструктивный обмен веществ заключается в биосинтезе основных клеточных компонентов из поступивших в клетку веществ питательной среды. Конструктивный обмен направлен на синтез четырех основных типов биополимеров: белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Синтез протекает как серия последовательных реакций с образованием разнообразных промежуточных продуктов метаболизма. Кроме того, уровни развития биосинтетических способностей микроорганизмов различны. Именно поэтому микроорганизмы резко отличаются друг от друга по своим потребностям в питательных ве­ществах. Независимо от их потребностей в питательной среде должны содержаться все элементы, которые имеются в клетках микроорганизмов. По отношению к источникам углерода все микроорганизмы делятся на две большие группы: автотрофы и гетеротрофы. Соответственно и тип питания этих микроорганизмов называется либо автотрофным, либо гетеротрофным. Микроорганизмы, использующие для биосинтеза веществ клетки неорганический источник углерода (СО₂),называются автотрофами. Микроорганизмы, которые не могут использовать СО₂ в качестве единственного источника углерода, и нуждаются в органических соединениях, называются гетеротрофами. К гетеротрофам относится большинство микроорганизмов.

Многие гетеротрофные микроорганизмы для синтеза веществ клетки в качестве источника углерода используют в основном углеводы, а также спирты, но, кроме того, могут использовать липиды, белки, аминокислоты (их углеродный скелет) и гораздо реже - органические кислоты. По отношению к источнику азота микроорганизмы делятся на аминоавтотрофы и аминогетеротрофы. Аминоавтотрофы усваивают азот из минеральных соединений (нитратов, нитритов, аммонийных солей и т.п.) Аминогетеротрофы нуждаются в готовых органических азотсодержащих соединениях (белках, аминокислотах, пуринах, пиримидинах), которые они используют одновременно как источник углерода и азота.

Среди гетеротрофов имеются микроорганизмы, резко различающиеся, но потребностям в питательных веществах. В связи с этим гетеротрофы подразделяются на две группы: сапрофиты и паразиты.

Сапрофиты питаются за счет органических веществ отмерших животных и растений. К ним относятся гнилостные бактерии, мицелиальные грибы, актиномицеты, дрожжи, бактерии-возбудители процессов брожения и др.

Паразиты питаются за счет органических веществ живого организма хозяина. В их число входят все болезнетворные микроорганизмы, включая вирусы, вызывающие заболевания человека, животных, растений.

Поступление воды и питательных веществ из окружающей среды и выделение продуктов метаболизма у микроорганизмов происходит через всю поверхность клеток. Вещества питательной среды должны обладать растворимостью в воде или в липидах, поскольку они могут проникать внутрь микробной клетки только в растворенном виде; продукты метаболизма выводятся из клетки также в растворенном состоянии. Нерастворимые сложные органические вещества (белки, полисахариды, жиры и др.) питательной среды предварительно подвергаются расщеплению вне клетки на более низкомолекулярные соединения, обладающие растворимостью в воде (аминокислоты, моносахариды, органические кислоты и др.), с помощью выделяемых во внешнюю среду микроорганизмами гидролитических ферментов.

Молекулы воды, некоторых газов О₂, Н₂, N₂, некоторые ионы, концентрация которых во внешней среде выше, чем в клетке, перемещаются через ЦПМ внутрь клетки путем пассивной диффузии. Пассивный перенос веществ протекает до тех пор, пока концентрация веществ по обе стороны ЦПМ не выровняется. Вода - основное вещество, которое проникает в клетку путем пассивной диффузии.

В клетку из питательной среды поступают только те питательные вещества, для которых в ЦПМ имеются соответствующие переносчики, и в этом проявляется избирательная проницаемость ЦПМ.

.

Рис 28. Транспорт веществ через цитоплазматическую мембрану:

а - цитоплазма: б - мембрана; в- окружающая среда: р – переносчик

Пермеазы обладают строгой специфичностью к субстрату, т.е. каждый из них переносит только определенное веще­ство. Переносчик вступает во взаимодействие с веществом на наруж­ной стороне ЦПМ, и этот комплекс диффундирует через ЦПМ к внут­ренней стороне ЦПМ, комплекс распадается и затем вещество пере­дается в цитоплазму. После этого переносчики "захватывают" опреде­ленные продукты обмена, выносят их из клетки и процесс повторяется. Таким образом, в клетку из питательной среды поступают только те вещества, для которых в ЦПМ имеются соответствующие переносчики, и в этом проявляется избирательная проницаемость ЦПМ.

С помощью переносчиков осуществляется перенос растворенных веществ питательной среды путем облегченной диффузии и активного транспорта.

Облегченная диффузия происходит по градиенту концентрации, как и пассивная диффузия, она протекает тоже без затраты энергии, но с большей скоростью

Активный транспорт веществ идет против градиента концентра­ции, т.е. от меньшей концентрации к большей, что обязательно сопро­вождается затратой энергии. Попав внутрь клетки, вещество осво­бождается от переносчика также с затратой энергии. При активном транспорте скорость поступления вещества в клетку достигает макси­мума уже при малой концентрации его в питательной среде, причем концентрация этого вещества в клетке может значительно превысить его концентрацию в питательной среде.

Прокариоты и эукариоты различаются по механизмам транспор­та - у прокариот избирательное поступление питательных веществ происходит путем активного транспорта, у эукариот - путем облегчен­ной диффузии. Вывод продуктов обмена из клеток микроорганизмов чаще всего осуществляется путем облегченной диффузии.

Энергетический обмен

Для переноса питательных веществ через ЦПМ и синтеза из них основных компонентов клетки, размножения, движения, микроорга­низмам необходима энергия, поэтому отдельные химические реакции, обусловливающие построение веществ тела микроорганизмов (биосинтез), должны быть сопряжены с реакциями, в результате кото­рых выделяется энергия.

Совокупность окислительно-восстановительных реакций, проте­кающих в клетке, за счет которых клетка получает энергию, называется энергетическим обменом.

Способ получения энергии микроорганизмом зависит от набора окислительно-восстановительных ферментов, входящих в состав его клетки.

Все способы получения энергии в основном сводятся к окислению молекул восстановленных веществ и восстановлению молекул окисленных веществ. Эти реакции объединены под названием биологическое окисление.

Энергетические процессы по своему объему значительно превосходят конструктивные. Микроорганизмы могут использовать энергию видимого света (фототрофы) и химическую энергию, высвобождающуюся при окислении различных восстановленных соединений (хемотрофы). В зависимости от способа получения энергии и используемого источника углерода все микроорганизмы делятся на фото- и хемоавтотрофы, фото- и хемогетеротофы .

Способы получения энергии хемогетеротрофами лежат в основе важнейших биохимических процессов, используемых в пищевых про­изводствах или лежащих в основе порчи сырья, полуфабрикатов и го­товой продукции пищевых производств с помощью микроорганизмов. В качестве источников энергии они могут использовать широкий круг органических веществ, чаще углеводы, а также спирты (одноатомный - этиловый спирт, трехатомный - глицерин; шестиатомные спирты - сорбит, маннит и др.), аминокислоты, пурины, пиримидины, жиры, органические кислоты и др.

Хемогетеротрофы могут получать энергию полным окислением (дыханием), неполным окислением, брожением, анаэробным дыханием.

Контрольные вопросы

1.Каков химический состав микроорганизмов?

2.Каков механизм поступления питательных веществ в микробную клетку?

3.Какие вещества необходимы для питания микроорганизмов?

4.В чем сущность автотрофного и гетеротрофного питания у микроорганизмов?

5.Какие виды энергии могут использовать микроорганизмы?

6.В чем разница между аэробами, строгими и факультативными анаэробами?

7.Что такое полное и неполное окисление субстрата?

8. Каково значение ферментов в процессах питания и дыхания микроорганизмов?

9.Какую роль играют факторы роста в жизни микроорганизмов?

10.Назовите способы получения энергии хемогетеротрофами?

Культивирование и рост микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов в микро­биологии. Оно основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для жизнедеятельности микроорганиз­мов.

Культивированием называют выращивание микроорганизмов на питательных средах в определенных условиях, а развивающийся при этом организм - культурой. Культивирование при определенной температуре называется инкубированием ( или инкубацией).

Строго го­воря, рост - это физиологический процесс, в ходе которого увеличиваются размеры и масса од­ной популяции. В результате размножения увеличивается число особей. Чистой называется культура, представляющая собой потомство одной клетки. В природе встречаются гетерогенные культуры, а в пищевых производствах, основанных на использовании биохимической деятельности микроорганизмов, применяют в основном чис­тые культуры дрожжей, молочнокислых, уксуснокислых бактерий и др. В последнее время в ряде производств находят успешное применение двух-, трехкомпонентные чистые культуры, состоящие из двух, трех видов микроорганизмов.

Для изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств любого микроорганизма из окружающей среды проводят его выделение в чистую культуру. Это дает возможность провести идентификацию микроорганизма и установить его таксономическое положение.

Выделение производят путем изолирования одной клетки микроорганизма одним из специальных приемов, затем осуществляют ее размножение на подобранной для данного мик­роорганизма питательной среде, создав элективные (избирательные) условия. Элективные ус­ловия обеспечивают преимущественное развитие выделяемой культуры и ограничивают разви­тие соответствующих микроорганизмов. Указанные условия можно создать путем использова­ния элективных сред. Перед выделением чистой культуры из какого-либо пищевого продукта или природного субстрата (почвы, воды, воздуха), в которой данный микроорганизм находится в небольшом количестве, получают накопительные культуры в элективных условиях. Внесение клеток микроорганизмов или какого-либо исследуемого материала в питательную среду для получения чистой или накопительной культур называют посевом. Перенесение выращенных клеток из одной среды в другую стерильную среду называется пересевом.

Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток одного вида микроорганизма, так как элективные среды в сочетании с элективными условиями ограничивают развитие сопутствующих микроорганизмов.

После получения накопительной культуры приступают к выделению чистой культуры. Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов до настоящего времени является метод, предложенный Р.Кохом. Разбавленную суспензию клеток накопительной культуры высевают на плотную среду с целью получения из каждой клетки отдельной колонии. Выросшая колония обычно состоит из клеток, развившихся от одной клетки, и является чистой.

Чистые культуры сохраняют в пробирках на плотной среде, периодически пересеивая их на свежие питательные среды. Другими способами хранения чистых культур микроорганиз­мов являются: хранение под слоем вазелинового масла, при низких и ультранизких температурах и в лио­филизированном состоянии.

Метод лиофилизации заключается в высушивании клеток из замо­роженного состояния под вакуумом, минуя жидкую фазу (по типу сублимации). Основные за­дачи хранения микроорганизмов - поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильно­сти таксономически важных признаков, а также определенных свойств, представляющих инте­рес для науки и практики. Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к созда­нию условий анабиоза, то есть к торможению процессов обмена веществ.

Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных микроорганиз­мов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях, которые хранятся в коллекции музея чистых культур.

Чистые культуры рассылаются научно-исследовательскими отраслевыми институтами на предприятия. В заводской лаборатории микробиолог подготавливает культуру для производственного цикла, проверяет ее биологическую чистоту, активность.

Разведение чистой культуры осуществляют путем посева микроорганизмов из коллекционной культуры в стерильную питательную среду и включает несколько последовательных пересевов в постепенно возрастающие объемы питательной среды.

Для культивирования микроорганизмов применяют питательные среды, которые должны содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Культивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного для культивирования микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивирования: накопление биомассы или получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.).

При периодическом способе культивирования чистая культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения, в течение которых изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства:

Первая стадия - лаг-фаза, или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду.

Вторая стадия - фаза логарифмического роста(экспоненциальная) характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена.

Рис. 29. Закономерность роста чистой культуры микроорганизма:

а - лаг-фаза; б - логарифмическая фаза; в - стационарная фаза; г- фаза отмирания.

Третья стадия - стационарная (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется, и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным.

Четвертая стадия - фаза отмирания, когда начинается гибель клеток и их количество снижается за счет отмирания и автолиза (самопереваривания).

В последние годы активно разрабатывается и применяется метод непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном (прикрепленном) состоянии - на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность.