I. Получение 6-апк

1. Уровень элюента в колонке спустить до уровня сорбента (надо следить за тем, чтобы сорбент не осушался!).

2. На колонку нанести осторожно (не взмучивая сорбент!) 2 мл раствора бензилпенициллина калиевой соли, который выдается каждому студенту под номером (задача). Небольшое количество (0,5 мл) раствора антибиотика должно остаться в пробирке в качестве раствора сравнения (контроль) при проверке эффективности процесса.

3. Пропустить раствор бензилпенициллина калиевой соли на колонку до уровня сорбента (элюат при этом собирается в мерную пробирку) и нанести 5-7 мл элюента.

4. Собрать элюат в количестве, соответствующем свободному объему колонки (5 мл с учетом п.3), в мерную пробирку, пропуская элюент со скоростью 30мл/час на см² сечения колонки (1 капля/с). Необходимо следить за тем, чтобы сорбент не осушался, при необходимости останавливая процесс и добавляя дополнительные порции элюента. Данный объем элюата не исследуется.

5. Следующую порцию элюата (2 мл), предположительно содержащую 6-АПК, собрать в отдельную стерильную пробирку.

6. Промыть колонку 5–7 мл элюента.

II. Оценка эффективности гидролиза бензилпенициллина.

Для оценки эффективности гидролиза бензилпенициллина до 6-АПК проверяют антимикробную активность полученного элюата (п.5). Для этого следует:

• приготовить взвесь тест-микроорганизма (Staphylococcus aureus 209Р) по стандарту мутности 1 млрд. кл/мл;

• внести полученную взвесь в расплавленный и охлажденный до 45-50^оС МПА из расчета 2 мл взвеси на 100 мл среды и перемешать;

• засеянную питательную среду разлить в стерильные чашки Петри по 15 мл (работа выполняется бригадой из 3 человек) и дать застыть на воздухе;

• после застывания среды сделать в агаре по трафарету 6 лунок (для каждой задачи по 2 лунки);

• лунки пометить (по дну чашки) для каждой задачи: “K” – контроль (для исходного раствора антибиотика, см. п. 2), “О” – “опыт” (для раствора 6-АПК, предположительно полученной в результате работы);

• с помощью микропипетки заполнить лунку “О” элюатом своей задачи, а лунку “К” - исходным раствором антибиотика;

• чашки поместить (осторожно!) в термостат на 37^оС на 24 ч.

Через 24 ч вокруг лунок с исходным антибиотиком должна наблюдаться зона задержки роста St. aureus, а вокруг лунок с элюатом – рост тест-культуры (6-АПК практически не обладает антимикробной активностью) или небольшая зона задержки роста (при неполном разрушении бензилпенициллина до 6-АПК).