2. Спектрофотометричний метод визначення сумарних білків

Розчин білків налити в кварцову кювету і визначити його оптичну щільність при 280 і 260 нм (як розчин порівняння використовувати вихідний розчин фосфатного буфера). Ароматичні амінокислоти тирозин і триптофан, що містяться в білках, поглинають світло в області λ = 280 нм. Однак поглинання в цій області мають і нуклеїнові кислоти, хоча максимум поглинання останніх становить λ = 260 нм. Тому для визначення концентрації білка в розчинах названим методом використовують рівняння Варбурга-Христіана:

де с – вміст білка в мг/мл; D₂₈₀ і D₂₆₀ – оптична щільність розчинів при 280 і 260 нм; 1,55 і 0,76 – розрахункові коефіцієнти.

Вміст сумарних білків в наважці насіння (мг/г сухої маси) розрахувати за формулою:

де c – вміст білка в розчині, знайдений за формулою Варбурга-Христіана; V – об'єм витяжки в мл; m – маса наважки в грамах; 10 – коефіцієнт, що враховує розведення витяжки; 86 – суха маса повітряно-сухої маси наважки насіння,%; 60 – суха маса пророслого насіння,%.

Результати оформити у вигляді таблиці.

Культура	Маса наважки, г	Об'єм витяжки, мл	Оптична щільність		Концентрація білка в пробі, мг/мл	Концентрація білка в рослині, мг/г
			D280	D260

Зробити порівняльний аналіз отриманих результатів.

3. Виділення білків з вегетативних органів рослин

Зважити наважку 0,5 г свіжого рослинного матеріалу (листя ячменю, конюшини, бульби картоплі), подрібнити і розтерти у фарфоровій ступці з 4-кратною (за масою) кількістю фосфатного буфера з рН 8, що містить 0,2% бісульфіду натрію і декілька крапель етилового спирту. Гомогенат залити 10 мл холодною 5% ТХО, ретельно перемішати і помістити в холодильник на 20 хв. Потім гомогенат перенести в центрифужні пробірки і центрифугувати протягом 15 хв при 6000 об/хв для осадження білків. Після центрифугування надосадову рідину злити. Осад промити охолодженим 96% етанолом до повного зникнення зеленого забарвлення в надосадової рідини. Повторити центрифугування і до промитого осаду додати 2 мл 0,5 н NaOH. Помістити пробірки на 5 хв на киплячу водяну баню, після чого долити ще 5 мл 0,5 н NaOH, перемішати і центрифугувати 10 хв при 6000об/хв. Надосадову рідину перенести в мірний циліндр і виміряти загальний обсяг лужного гідролізату. Кількість білка в пробі визначити за методом Лоурі.

4. Визначення білків за методом Лоурі

Для визначення вмісту білків за методом Лоурі необхідно попередньо приготувати розчини: А – 2% Na₂CO₃ в 0,1 н NaOH; B – 0,5% CuSO₄×5H₂O в 1% K- або Na-виннокислому; C – суміш розчинів А і В (50:1 за обсягом); Е – реактив Фоліна.

Відібрати 1 мл лужного гідролізату, додати 5 мл розчину С, перемішати і через 10 хв додати 0,5 мл розчину Е. Суміш витримати протягом 30 хв. при кімнатній температурі, після чого виміряти оптичну щільність розчину при 750 нм на спектрофотометрі. Як розчин порівняння використовувати суміш: 1 мл 0,5 н NaOH, 5 мл розчину С і 0,5 мл реактиву Фоліна.

Для визначення вмісту білка в розчині необхідно побудувати калібрувальний графік по альбуміну або казеїну.

На аналітичних терезах зважити 100 мг альбуміну і розчинити в 100 мл фосфатного буфера. З цього стандартного розчину приготувати вихідні розчини з вмістом білка від 0,05 до 1,0 мг/мл згідно з таблицею:

№	Вміст білка, мг/мл	Стандартний розчин альбуміну, мл	Фосфатний буфер, мл	Оптична щільність, D750
1 2 3 4 5 6 7	0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0	0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 10	9,5 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 0

Послідовно відібрати 1 мл кожного з розчинів альбуміну, перенести в чисті попередньо пронумеровані пробірки і додати, як і у випадку дослідних розчинів, 5 мл розчину С, а через 10 хв 0,5 мл розчину Е. Вміст кожної з пробірок обережно перемішати і залишити при кімнатній температурі на 30 хв. Після закінчення зазначеного часу виміряти оптичну щільність розчинів при довжині хвилі λ = 750 нм.

За даними, отриманими для стандартних розчинів, побудувати калібрувальний графік (на осі ординат – величина оптичної щільності, на осі абсцис – концентрація білка).

Користуючись калібрувальною кривою знайти концентрацію білка в досліджуваному розчині. Загальний вміст білка в вегетативної частини рослини (мг/г сирої маси) розрахувати за формулою:

де с – концентрація білка в досліджуваному розчині в мг/мл; V – об'єм лужного гідролізату в мл; m – маса наважки рослинного матеріалу в грамах.

Результати оформити у вигляді таблиці.

Культура

Маса наважки, г

Оптична щільність, D750

Вміст білка в розчині, мг/мл

Вміст білка в рослині, мг/г

Зробити висновки.