Лабораторна робота № 4 Визначення вмісту білка в насінні і у вегетативній масі різних культур

Вміст білка у різних культур сильно варіює. Це обумовлено генотипічними особливостями видів, сортів, а також умовами їх вирощування. Крім того, білки нерівномірно розподілені в тканинах рослин. Мало білкових речовин в старих стеблах і коренях, тоді як в листках та насінні може міститися значна кількість білка. Так, у вегетативній масі конюшини, люцерни, вики вміст білка становить до 20% на суху речовину, а в насінні пшениці, ячменю, кукурудзи варіює в межах 10 – 30%. У насінні бобових культур, наприклад у сої кількість білка може досягати 50%.

З насіння бобових і олійних культур досить легко отримати препарати білків для вивчення їх хімічного складу і будови. Виділення білкових речовин з вегетативних органів рослин ускладнене, так як в них білки міцно пов'язані з вуглеводами та іншими сполуками.

Екстракція білків з рослинної тканини заснована на їхній здатності розчинятися при руйнуванні тканин у воді, розчинах солей, кислотах і лугах, буферних розчинах. Буферні розчини забезпечують м'які умови виділення білків, при яких зберігається природна структура їх молекул. Для виділення більшої частини білкових речовин (препарат сумарного білка) використовують буферні розчини з рН 8.

Існує кілька методів кількісного визначення білків в рослинних тканинах. Нижче представлена робота за спектрофотометричним та колориметричним методам визначення сумарного вмісту білка в рослинному матеріалі.

Мета цієї роботи – визначити кількість білка в насінні різних зернових і зернобобових культур, а також у вегетативній масі рослин.

Реактиви та матеріали: дистильована вода, фосфатний буфер (рН 8), Na₂HPO₄×2H₂O, NaH₂PO₄×H₂O, бісульфід натрію, етиловий спирт, трихлороцтова кислота (ТХО), NaOH, Na₂CO₃, CuSO₄×5H₂O, K- або Na-виннокислий, реактив Фоліна, альбумін або казеїн, порцелянова ступка і товкач, кварцовий пісок, колба Бунзена, ротатор, конічні колби об'ємом 100 мл, мірні циліндри, пробірки, морозильна камера, центрифуга.

Хід роботи

1. Виділення сумарних білків з насіння зернових і зернобобових рослин

Наважку 1 г сирого пророслого насіння (пшениця, ячмінь, квасоля, горох, люпин, соя) помістити в фарфорову ступку. Додати невелику кількість кварцового піску і ретельно розтерти з 40 мл фосфатного буфера (рН 8), що містить 0,2% бісульфіту натрію і декілька крапель етилового спирту. При використанні сухого насіння його необхідно попередньо розмолоти до стану борошна, і після додавання фосфатного буфера настояти протягом години.

Для приготування 0,1 М фосфатного буфера з рН 8,0 необхідно взяти 95 мл 0,2 М розчину Na₂HPO₄×2H₂O додати 5 мл 0,2 М розчину NaH₂PO₄×H₂O і довести об'єм водою до 200 мл.

Гомогенат кількісно перенести в конічну колбу на 100 мл і довести обсяг фосфатним буфером до 50 мл. Вміст колб перемішувати на ротаторі протягом 1 год. Після закінчення зазначеного часу колби дістати з ротатора і дати витяжці відстоятися протягом 15 хв. Потім за допомогою піпетки з верхньої частини гомогенату обережно відібрати 10 мл розчину і перенести в центрифужні пробірки. Провести центрифугування розчину протягом 15 хв при 3000 об/хв при кімнатній температурі. По закінченні центрифугування з пробірок відібрати піпеткою 1 мл надосадової рідини і перенести в іншу пробірку. Туди ж необхідно додати 9 мл фосфатного буфера з рН 8, ретельно перемішати, після чого розчин сумарних білків готовий до спектрофотометрії.