Лабораторна робота № 2 Фотоколориметричне визначення тріоз у рослинному матеріалі (за г.Н. Чупахіною, м.В. Куркиною)

Ендогенний пул тріоз рослин формується за рахунок діоксіацетонфосфату і фосфогліцерінового альдегіду, які утворюються в результаті фотосинтетичного, дихального метаболізму і глюконеогенезу, що визначає участь даних моносахаридів в найважливіших енергетичних процесах. Метод заснований на здатності тріоз кількісно відновлювати в лужному середовищі трифенілтетразолій хлористий (ТТХ) до формазану, який має червоне забарвлення. Розчинивши його в ацетоні, можна колориметрично визначити кількість тріоз у розчині, враховуючи максимум поглинання формазану при довжині хвилі 490 нм.

Мета цієї роботи – визначити кількість тріоз (діоксіацетонфосфату і фосфогліцерінового альдегіду) в різних рослинних об'єктах.

Реактиви та матеріали: 0,2%-ний розчин ТТХ, 2 н. розчин NaOH, 3 н розчин HCl, очищений ацетон, діоксіацетон, сульфатна кислота (95 - 96%-на), ножиці, конічні колби на 50 мл, мірні колби на 25 мл, пеніцилінові флакони, водяна баня, дистильована порцелянова ступка і товкач, мірні циліндри, пробірки, фотоелектроколориметр.

Хід роботи

Наважку досліджуваного матеріалу (0,5 – 1,0 г листя) подрібнюють ножицями і ретельно розтирають у ступці до гомогенного стану з невеликою кількістю (1 – 2 мл) дистильованої води. Отриманий гомогенат кількісно переносять дистильованою водою (15 мл) в конічну колбу на 50 мл. Колбу з вмістом добре перемішують і поміщають на киплячу водяну баню, витримують протягом 30 хвилин, періодично помішуючи. Потім колбу знімають з водяної бані, охолоджують до кімнатної температури і вміст її кількісно переносять у мірну колбу на 25 мл, об'єм доводять до мітки дистильованою водою. Екстракт добре перемішують і фільтрують.

До 0,5 мл фільтрату додають 1 мл суміші 0,2%-ного розчину ТТХ і 2 н розчину NaOH у співвідношенні 1:1, змішаних перед застосуванням. Одночасно готують контрольний розчин, для якого замість фільтрату беруть 0,5 мл дистильованої води. Реакцію можна проводити в пеніцилінових флаконах. Флакони закривають і ставлять на 15 хвилин у темряву до появи рожевого осаду формазану. Для розчинення осаду формазану додають спочатку 0,5 мл 3н розчину HCl, а потім 3 мл очищеного ацетону. Оптичну щільність вимірюють на КФК-2 за синім світлофільтром при довжині хвилі 490 нм у порівнянні з контролем.

Кількість тріоз в 1 мл досліджуваного розчину визначають, використовуючи калібрувальну криву для діоксіацетона або формулу. Розраховують кількість тріози на 1 грам рослинного матеріалу.

Побудова калібрувальної кривої. Для побудови калібрувальної кривої 0,1 г діоксіацетона, попередньо висушеного в ексикаторі над концентрованою сульфатною кислотою (95 – 96%-на), розчиняють в 200 мл дистильованої води. Утворюється розчин, 1 мл якого містить 500 мкг діоксіацетона. З даного розчину роблять серію розведень, що містять 5, 10, 15, 20, 25, 30 мкг діоксіацетона в 1 мл.

З кожного розведення беруть по 0,5 мл розчину, додають до нього по 1 мл суміші 2 н розчину NaOH і 0,2%-ного розчину ТТХ у співвідношенні 1:1, змішаних перед застосуванням, і ставлять на 15 хвилин у темряву до появи рожевого забарвлення. Потім для розчинення осаду додають 0,5 мл 3 н розчину соляної кислоти і 3 мл ацетону. Одночасно готують контрольний розчин, що містить в якості проби 0,5 мл дистильованої води. Визначають оптичну густину розчинів на КФК-2 при довжині хвилі 490 нм у порівнянні з контролем.

Визначення проводять в 2 – 4 повторностях. Дані обробляють методом найменших квадратів і за отриманими результатами будують калібрувальну криву.