2. Одержання тіохрому

У ділильні воронки об'ємом 50 мл налити 2,5 мл отриманого екстракту. В одну з воронок (контрольну) прилити 1,5 мл 15% розчину NaOH, перемішати і додати 6 мл ізобутилового спирту. В дослідні воронки додати по 1,5 мл 0,04% розчину червоної кров'яної солі в 15% розчині NaOH, весь вміст перемішати і долити 6 мл ізобутилового спирту. Ділильні воронки закрити пробками і ретельно струшувати протягом 1 хв. Дати суміші відстоятися, потім нижній шар слід злити. Для освітлення спиртового шару прилити 1 мл етилового спирту, ретельно перемішати, дати відстоятися і отриманий прозорий розчин злити в пробірку для подальшого спектрофотометричного аналізу.

3. Флуоресцентна спектроскопія розчинів тіохрому і рибофлавіну

Отримані дослідні розчини тіохрому перелити в кювети і провести вимірювання інтенсивності флуоресценції (довжина хвилі збудження λ = 250 нм). Максимум флуоресценції для тіохрому становить λ = 495 – 500 нм.

Аналогічно провести процедуру вимірювання інтенсивності флуоресценції для розчинів рибофлавіну (довжина хвилі збудження дорівнює λ = 225 нм). Реєструвати максимум флуоресценції рибофлавіну в області λ = 525 – 530 нм.

Враховуючи, що спектральні властивості окислених і відновлених форм тіаміну і рибофлавіну змінюються, провести їх порівняльний флуоресцентний аналіз. Рибофлавін окиснюється 4% розчином перманганату калію, який додається в екстракт по краплях до зникнення червонуватого забарвлення, або концентрованої HCl у присутності металевого цинку. Відновлення окислених форм тіаміну і рибофлавіну здійснити або гідросульфітом натрію (Na₂S₂O₄×H₂O) або боргідридом натрію (NaBH₄), додаючи ці відновники в кількості 0,1 – 0,2 г на 1 – 2 мл розчину вітамінів.

Результати оформити у вигляді таблиці:

Вітамін	Збудження флюоресценції, нм		Інтенсивність флюоресценції, відносні одиниці
	окислена форма	відновлена форма	окислена форма	відновлена форма
В1
В2

4. Кількісне визначення вітамінів в1 і в2

Для кількісної оцінки вмісту вітамінів у рослинних зразках слід отримати калібрувальні графіки залежності інтенсивності флюоресценції від концентрації. З цією метою необхідно:

• приготувати стандартні розчини вітамінів тіаміну і рибофлавіну (10 мг тіаміну броміду (тіаміну хлориду) розчинити в 100 мл 0,01 н розчину HCl, 10 мг рибофлавіну розчинити в 100 мл 0,01 н розчину NaOH);

• провести окислення стандартного розчину тіаміну. Для цього в ділильну лійку налити 1 мл робочого розчину і додати 4 мл води. (Примітка. Робочий розчин приготувати безпосередньо перед окисленням. Для цього взяти 1 мл стандартного розчину і довести його до 100 мл дистильованою водою – 1 мл цього робочого розчину міститиме 1 мкг тіаміну броміду). Потім у воронку прилити лужний розчин червоної кров'яної солі і провести процедуру розділення та освітлення розчинів, як це описано вище. Окислений і освітлений розчини перелити в пробірки для флуориметрії;

• приготувати робочий розчин рибофлавіну. Для цього слід взяти 1 мл стандартного розчину рибофлавіну і довести його до 100 мл дистильованою водою (1 мл цього розчину міститиме 1 мкг рибофлавіну);

• побудувати калібрувальні криві для розчинів тіохрому і рибофлавіну, взявши наступні концентрації для тіаміну – 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 мкг, а для рибофлавіну – 0,005; 0,010; 0,020; 0,05 мкг. За калібрувальними кривими розрахувати вміст тіаміну і рибофлавіну (мкг/мл) в рослинних зразках. Кількість вітамінів в досліджуваному матеріалі (мкг/г сирої маси) обчислити за формулою:

де с – вміст вітамінів в 1 мл витяжки, знайдений по каліброваною кривою; V – об'єм екстракту в мл; m – маса досліджуваного матеріалу в грамах.

Зробити висновки.