Лабораторна робота № 11 Визначення вітамінів в1 і в2 в рослинах

У рослинах вміст вітамінів невеликий. Разом з тим окремі органи і тканини рослин здатні більшою мірою накопичувати їх у своєму складі. Так, овочеві та плодові культури характеризуються високим вмістом каротиноїдів, вітаміну Р, аскорбінової і фолієвої кислоти. У насінні злакових і зернобобових культур багато рибофлавіну, тіаміну, ніацину. У зеленому листі рослин накопичуються філохінон.

Тіамін, або вітамін В₁, у вигляді тіамінпірофосфату входить до складу окислювальних декарбоксилаз кетокислот. Методи визначення тіаміну засновані на його спектральних властивостях. Максимум поглинання тіаміну становить λ = 250 нм. Продукт окислення тіаміну червоною кров'яною сіллю у лужному середовищі – тіохром флуоресціює при ультрафіолетовому освітленні.

Рибофлавін, або вітамін B₂, ідентифікований в природних об'єктах у вигляді чотирьох форм, одна з яких вільний рибофлавін, решта зв'язані з нуклеотидами (флавінмононуклеотид, флавінаденіндинуклеотид) і з білком. Рибофлавін входить до складу простетичної групи флавінових ферментів, які здійснюють реакції дегідрування. Окислена форма рибофлавіну так само, як і тіаміну, здатна флуоресціювати в ультрафіолетовому світлі. Максимум поглинання рибофлавіну лежить в області λ = 225 нм.

Мета роботи – якісне і кількісне визначення вітамінів B₁ і B₂ в екстрактах з вегетативних частин рослин, коренеплодів і плодів.

Реактиви та матеріали: 0,1 н розчин H₂SO₄, 10% трихлороцтова кислота (ТХО), 15% розчин NaOH, 1% розчин червоної кров'яної солі K₃[Fe(CN)₆], 0,1% розчин NaOH, бромід тіаміну (хлорид тіаміну), рибофлавін, Na₂S₂O₄×H₂O або NaBH₄, металевий цинк, пепсин або трипсин, ізоаміловий спирт, ізобутиловий спирт, етиловий спирт, діетиловий ефір, дистильована вода, фарфорові ступки з товкачами, конічні колби об'ємом 100 мл, водяна баня, мірні циліндри, пробірки, ділильні воронки об'ємом 50 мл, паперові фільтри, термостат, центрифуга, флуоресцентний спектрофотометр.

Хід роботи

1. Екстракція вітамінів

До наважки подрібненого рослинного матеріалу масою 10 – 20 г прилити невелику кількість (2 – 5 мл) 0,1 н розчину Н₂SO₄, після чого все ретельно розтерти в ступці. Розтерту масу помістити в конічну колбу на 100 мл, сюди ж додати 30 мл 0,1 н розчину Н₂SO₄. Вміст колби слід витримати протягом 20 хв. на киплячій водяній бані для екстрагування вітамінів. Після завершення процедури екстрагування суміш охолодити і додати в колбу 30 мг пепсину або трипсину для перетворення вітаміну у вільний стан. Обсяг гомогенату довести до 50 мл розчином сульфатної кислоти. Провести ферментацію протягом 20 год. у термостаті при 38 ºС.

Після закінчення зазначеного терміну екстракт відцентрифугувати при 5000 об/хв і відфільтрувати під вакуумом. До надосадової рідини прилити рівний об'єм 10% ТХО і випарувати до 10 мл. Продовжити випарювання екстракту, видаляючи надлишок ТХО 2–3-кратним промиванням сумішшю етилового спирту і діетилового ефіру (1:1), до обсягу 5 мл. Далі отриманий екстракт розділити на дві частини: одну використати на визначення тіаміну, а другу – рибофлавіну.