IX.4.2.2. Пептидный синтез.

Синтез полипептидных цепей – намного более сложная задача, чем синтез ранее описанных полиэфиров и полиамидов; это, прежде всего, связано с тем, что, в отличие от монотонно построенных полиэфиров и полиамидов, белки имеют специфическую первичную структуру, которую необходимо воссоздать в ходе синтеза. Поэтому синтез даже коротких пептидных цепей, не говоря о высокомолекулярных, является многостадийным процессом.

При синтезе природных пептидов и белков (а также их аналогов) необходимо решить следующие проблемы:

1. Проблема активности. Необходимо обеспечить прохождение синтеза в мягких условиях (и, желательно, с достаточно большой скоростью).

2. Проблема селективности. Необходимо обеспечить протекание реакции таким образом, чтобы карбоксильная функция предыдущей аминокислоты реагировала только с аминофункцией последующей (если вести синтез с N-конца). Все остальные варианты должны быть исключены. Для иллюстрации рассмотрим формальный синтез дипептида из аминокислот I и II:

Ч тобы получить дипептид именно этой структуры (I – II), необходимо, чтобы карбоксильная функция аминокислоты I (“карбоксильной компоненты”) реагировала только с аминогруппой аминокислоты II (“аминокомпоненты”). Необходимо исключить взаимодействие двух одинаковых молекул (I – I и II – II), а также карбоксильной функции аминокислоты II с аминофункцией аминокислоты I (II – I).

3. Проблема выхода продуктов реакций. Синтез достаточно длинных пептидов и, тем более, белков – многостадийный процесс, поэтому выходы продуктов на каждой стадии должны быть очень высокими, желательно близкими к количественным.

4. Проблема сохранения пространственной конфигурации. В пептидном синтезе используют индивидуальные энантиомеры -аминокислот (L-аминокислоты). При этом необходимо, чтобы пространственная конфигурация при асимметрическом атоме углерода каждой аминокислоты в ходе реакции сохранялась; если это не соблюдается, биологическая активность синтезированного пептида или белка меняется или даже теряется. Поэтому асимметрические атомы углерода аминокислот не должны участвовать в реакциях; «на бумаге» кажется, что они в них и не участвуют, однако возможны побочные реакции, затрагивающие эти атомы; этих реакций необходимо избежать.

Для решения проблем активности и селективности используют два основных подхода:

1. Защита амино- и карбоксильных групп. А. Защищают аминогруппу карбоксильной компоненты для того, чтобы она не могла вступать в реакцию. Б. Защищают карбоксильную группу аминокомпоненты, чтобы избежать диполярной (цвиттерионной) структуры этой аминокислоты и высвободить аминогруппу.

2. Активация карбоксильной группы. Карбоксильную группу карбоксильной компоненты превращают в производное, обладающее повышенной реакционной способностью. Это позволяет увеличить скорость реакции, а также обеспечивает селективность.

С учетом этих подходов пептидный синтез проходит по следующей схеме:

П ри синтезе дипептида в роли карбоксильной компоненты выступает модифицированная аминокислота (726), где Z - защитная группа для амино-функции, Х - активирующая группа для карбоксильной функции; в роли аминокомпоненты выступает модифицированная аминокислота (727), где Y- защитная группа для карбоксильной функции. При их взаимодействии образуется модифицированный по концевым группам дипептид (728). Для дальнейшего синтеза снимают защиту либо с амино-, либо с карбоксильной функции. Если снята группа Z, то освободившаяся аминогруппа реагирует с активированной карбоксильной группой третьей аминокислоты с образованием трипептида (729). Если снята группа Y, то освободившуюся карбоксильную группу активируют и вводят в реакцию со следующей аминокомпонентой, получая трипептид (730). Многократно повторяя эту последовательность реакций, можно получать полипептидные цепи с достаточно большим числом звеньев. При этом можно наращивать цепь по одному звену, вводя каждый раз новую аминокислоту (линейный синтез), или сшивать пептиды между собой (конвергентный синтез).

Приведенная схема является упрощенной: кроме указанных операций, необходимо защищать группы, находящиеся в боковых группах R_i; как известно, в них могут содержаться группы NH_2, СООН, ОН, SH и другие. Более подробно эти проблемы обсуждаются в специальных курсах.

Защита аминогруппы.

Основные требования к защите аминогруппы: 1. Она должна значительно уменьшать реакционную способность аминогруппы, т.е. снижать ее нуклеофильность. 2. Она должна легко сниматься без разрыва образовавшихся пептидных связей, а также без побочных реакций, могущих неблагоприятно повлиять на получаемый пептид.

К настоящему времени известно достаточно много способов защиты аминогруппы; наиболее широко используется уретановая защита.

Для ее введения аминокислоту обрабатывают производным моноэфира угольной кислоты, например, эфиром хлоругольной кислоты:

В результате образуется уретановый фрагмент (см. стр. 359); атом азота аминогруппы становится амидным – это резко понижает его нуклеофильность (стр. 343). Может возникнуть вопрос: почему не использовать для защиты ацилирование более доступными хлорангидридами обычных карбоновых кислот, например, уксусной? Однако снять такую «простую» ацильную защиту без разрыва образующихся в синтезе пептидных связей, как правило, невозможно – ведь пептидная связь, по существу, такая же, как и амидная связь в ацилированной аминогруппе. Напротив, уретановый фрагмент – производное карбаминовой кислоты – можно расщепить в мягких условиях без разрыва пептидной связи.

Упомянем два широко используемых варианта уретановой защиты:

А. Бензилоксикарбонильная защита (R=C₆H₅CH₂); это исторически первый пример уретановой защиты аминогруппы в пептидном синтезе (М. Бергманн, Л. Зервас, 1932 г.). После образования пептидной связи эта защита снимается путем каталитического гидрирования над палладием в мягких условиях:

Безилоксикарбонильная группа удаляется в виде толуола и СО₂; пептидная связь сохраняется.

Б. трет-Бутоксикарбонильная защита [R=(CH₃)₃C]; ее часто называют Вос-защитой. Эта защита устойчива к каталитическому гидрированию, но легко снимается обработкой трифторуксусной кислотой или HBr в уксусной кислоте; защитная группа удаляется в виде летучих продуктов:

К настоящему времени разработано много других вариантов уретановой защиты, в которых она снимается в исключительно мягких условиях.

Защита карбоксильной группы.

Для защиты карбоксильной группы получают сложные эфиры по этой группе; при снятии защиты эти эфиры должны гидролизоваться в таких условиях, в которых сохраняется пептидная связь. Часто получают бензиловые или трет-бутиловые эфиры; эти защиты снимаются в условиях, сходных с условиями снятия аналогичных уретановых защит: бензиловые эфиры расщепляются гидрогенолизом (каталитическим гидрированием, см. схему), а трет-бутиловые – мягкой кислотной обработкой:

А ктивация карбоксильной группы

Карбоксильная группа недостаточно активна в реакциях с нуклеофилами, поэтому для эффективного образования пептидной связи необходимо сделать ее более электрофильной. Это достигается превращением карбоксильной группы в производные, содержащие электроноакцепторные группы, которые увеличивают частичный положительный заряд на карбоксильном атоме углерода:

Самый «напрашивающийся» вариант активации – получение хлорангидридов (Х=С1) – не применяется: хлорангидриды слишком активны, их использование сопровождается побочными реакциями и рацемизацией. Наиболее используемые сейчас варианты активированных карбоксильных групп: А.«Активированные» сложные эфиры – п-нитрофениловый (Х=ОС₆Н₄-NO₂-4) или цианометиловый (Х=ОСН₂СN); активация достигается за счет электроноакцепторных нитро- и цианогрупп; Б. Азиды (X = N=N⁺=N^¯ ); В. Ангидриды; наиболее часто используются смешанные ангидриды аминокислот и производных угольной кислоты (Х = О-СО-ОR).

С учетом приведенных выше методов защиты и активации функциональных групп можно привести более конкретные примеры образования пептидной связи (на примере синтеза дипептидов):

З ащищенные по N- и С-концам дипептиды (731) и (732) можно использовать в дальнейших синтезах после снятия защиты с одного из концов.

Известен вариант, позволяющий совместить активацию карбоксильной компоненты и образование пептидной связи; этот вариант – использование в пептидном синтезе карбодиимидов, обычно N,N’-дициклогексилкарбодиимида (DCC, см. стр. 363). Этот реагент прибавляют к смеси N-защищенной карбоксильной компоненты и С-защищенной аминокомпоненты; при этом происходит активирование карбоксильной группы и сразу вслед за этим – образование пептидной связи:

В начале происходит нуклеофильное присоединение по связи С=N реагента DCC и образуется О-ацилизомочевина (733); в ней карбоксильная функция аминокислоты активирована по схеме, аналогичной образованию смешанного ангидрида с производным угольной кислоты. Соединение (733) немедленно реагирует с аминокомпонентой; образуется защищенный дипептид, а активирующая группа отщепляется в виде дициклогексилмочевины.

Данный вариант сокращает число стадий пептидного синтеза, но не свободен от побочных реакций.

Пептидный синтез на полимерном носителе.

Решение проблемы выхода продуктов реакции – это обеспечение полноты протекания реакции и легкости отделения целевого продукта реакции от других продуктов (прежде всего, от избытка реагента и других продуктов данной реакции). В пептидном синтезе эта проблема во многом решается использованием специального метода – синтеза на полимерном носителе (твердофазного пептидного синтеза); он был предложен Р. Меррифилдом (1963). Суть метода: первая аминокислота (обычно С-концевая кислота будущего полипептида), защищенная по аминогруппе, химически связывается с нерастворимым полимером. Структура этого полимера здесь подробно не обсуждается; это может быть, например, модифицированный полистирол, содержащий боковые группы СН₂С1 (обозначим его символом РСН₂С1). Далее проводят пептидный синтез, причем растущая полимерная цепь все время связана с полимерным носителем. По окончании наращивания пептидной цепи ее отделяют от полимера. Общую схему синтеза можно представить следующим образом:

Соль защищенной С-концевой аминокислоты реагирует с группой СН₂С1 полимера, образуя сложный эфир (724) (обычное нуклеофильное замещение); таким образом, аминокислота химически связывается с полимером. Далее защиту Z (обычно это Вос-защита) снимают, образовавшееся соединение (725) вводят в реакцию со следующей защищенной аминокислотой в присутствии дициклогексилкарбодиимида (DCC); образуется N-защищенный связанный с полимером дипептид (726). Повторяя операции снятия защиты Z и взаимодействия с очередной N-защищенной аминокислотой в присутствии DСС, синтезируют прикрепленный к полимеру защищенный по N-концу целевой полипептид (727). После специальной кислотной обработки (например, безв. HF) пептидная цепь отделяется от полимера, а защита Z снимается; образуется целевой полипептид (728).

Растущая пептидная цепь с самого начала (с первого звена) нерастворима, т.к. ковалентно связана с нерастворимым полимером. Поэтому все побочные продукты (прежде всего избыток реагента) легко удаляются промывкой, экстракцией или фильтрованием полимера (реагенты на каждой стадии берут в большом избытке, чтобы обеспечить полноту протекания каждой реакции). Это существенно повышает эффективность синтеза.

Биосинтез белков осуществляется в ходе одного из важнейших генетических процессов – трансляции. Полипептидная цепь белка образуется путем матричного синтеза, т.е. в соответствии с программой, записанной в виде структуры специальной молекулы-матрицы. Молекулой-матрицей является матричная (информационная) РНК (мРНК); содержащаяся в ней информация скопирована с соответствующего участка ДНК- гена (точнее с его кодирующих участков – экзонов). Для считывания информации используются молекулы-адапторы – транспортные РНК (т-РНК), которые обеспечивают узнавание аминокислотами «своих» участков матрицы. Само считывание происходит в комплексе м-РНК со специальной органеллой – рибосомой; образование пептидных связей происходит при действии ферментов. Комплекс м-РНК-рибосома обеспечивает точную ориентацию реагирующих структур – C-конца растущей пептидной цепи и очередной аминокислоты; ферментативный катализ обеспечивает очень высокую скорость реакции. Защита аминогруппы здесь не требуется; лишь карбоксильная группа «защищена» молекулой т-РНК, которая образует с аминокислотой сложный эфир; типовая стадия синтеза – увеличение пептидной цепи на одно звено – может быть представлена схемой:

М атричный синтез полипептидных цепей рассматривается в курсе биоорганической химии и в специальных курсах.