Задача 5. Дать понятия прото- и ауксотрофности.

Для этого надо знать:

1. Микроорганизмы, способные синтезировать все соединения из глюкозы (как источника углерода) и солей аммония (как источника азота) являются прототрофами.

2. Если же они не способны синтезировать какое-либо соединение, то являются ауксотрофами (многие патогенные бактерии и бактерии нормальной микрофлоры кишечника человека).

3. Для нормального роста и размножения те вещества, которые микроорганизмы не способны синтезировать, они должны получать в готовом виде из окружающей среды. Эти вещества называются факторами роста.

4. К факторам роста относятся аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые азотистые основания, нуклеозиды, нуклеотиды, липиды, инозит, холин, витамины В₅, В₂, В₁, В₃, В₆, биотин, фолиевая кислота, парааминобензойная кислота (ПАБК), гем.

5. Потребность в тех или иных факторах роста является видовым признаком, что может быть использовано для идентификации бактерий (например, Mycobacterium tuberculosis нуждается в геме, как в факторе роста; Corynebacterium diphteria – в витамине В₅).

Задача 6. Охарактеризовать механизмы переноса питательных веществ в бактериальную клетку.

Для этого надо знать:

1. Особенностью питания бактерий является поглощение веществ из среды всей поверхностью тела.

2. Питательные вещества могут проникнуть в клетку в виде относительно небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и т.д. предварительно гидролизуются экзоферментами бактерий до аминокислот, моносахаридов, глицерина и жирных кислот, а затем поступают в бактериальную клетку.

3. Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы (до 600), Н₂О, ионы. Цитоплазматическая мембрана обладает избирательной проницаемостью, поэтому она является основным регулятором поступления веществ в клетку.

4. Скорость поступления веществ зависит от величины и растворимости молекул в липидах и в воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран.

5. Существует несколько механизмов транспорта:

а) простая диффузия – осуществляется по градиенту концентрации веществ без затраты энергии; решающее значение при этом имеют размеры молекул и их растворимость в липидах;

б) облегченная диффузия – происходит при большей концентрации веществ вне клетки при участии пермеаз;

в) активный транспорт – осуществляется против градиента концентрации с затратой энергии при помощи транспортных белков;

г) транслокация химических групп – в процессе переноса через мембрану молекула вещества химически изменяется, т.к. в исходном виде эти вещества не проходят через мембрану (например, фосфорилирование глюкозы).

Задача 7. Описать условия культивирования бактерий.

Для этого надо знать:

1. Для изучения разнообразных свойств микроорганизмов в лабораторных условиях их искусственно выращивают, т.е. культивируют.

2. При культивировании микробам должна быть обеспечена возможность расти, размножаться и проявлять свою жизнедеятельность. Для этого необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О₂) или создание бескислородных условий.

3. Состав и свойства питательных сред должны соответствовать биологическим свойствам тех микроорганизмов, для выращивания которых они предназначены.

В качестве источника азота используются минеральные и органические соединения; для патогенных бактерий используют такие источники органических соединений, как мясо, рыба, плацента, кровь, дрожжи, кукуруза, ячмень. Так как все эти вещества должны быть в легко усвояемом для микробов виде, белки подвергают частичному расщеплению (протеолизу) и получают пептоны – смесь полипептидов и аминокислот.

В качестве источника углерода используют углеводы, спирты, органические кислоты.

Требования к питательным средам:

а) среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: источники азота, углерода, водорода и кислорода, минеральные соли (натрия, калия и т.д.), факторы роста для ауксотрофных микроорганизмов;

б) среды должны иметь определенное значение рН (отрицательный lg Н⁺); для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4; исключение: холерный вибрион (рН 8,0-8,6), туберкулезная палочка (рН 6,2-6,8); сапрофиты растут в условиях с более широким диапазоном рН – от 2 до 8,5;

в) среды должны обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы рН среды при выращивании микроорганизмов не изменялось;

г) среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 % NaCl;

д) среды должны быть стерильными для обеспечения возможности получения чистой культуры;

е) среды должные содержать достаточное количество доступной Н₂О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии; (за этим особенно необходимо следить при культивировании на плотных средах; чтобы избежать высыхания, разливать среды в чашки Петри или скашивать в пробирках следует в день посева; при культивировании микробов, особенно чувствительных к отсутствию влаги (например, гонококка) в термостат ставят открытый сосуд с водой);

ж) среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом rH₂; для аэробов rH₂ – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;

з) среды должны быть прозрачными – удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами;

и) среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота (т.е. суммарного азота NH₂-групп аминокислот и низших полипептидов) –0,8-1,2 г/л; содержание общего азота – 2,5-3,0 г/л; содержание хлоридов в пересчете на NaCl – 0,5 %; пептона – 1%.

4. Условия культивирования:

а) температура: для холодолюбивых (психрофильных) микробов – 6-20 С; для средних (мезофильных) – 34-37 С; для теплолюбивых (термофильных) – более 37 С (до 70-75 С);

б) аэрация для аэробов; доступ О₂ обеспечивается путем пассивной и активной аэрации.

При пассивной аэрации микробы потребляют О₂, растворенный в среде, а также находящийся над средой и поступающий в пробирку через ватно-марлевую пробку; при этом культивирование осуществляют на поверхности или в тонком слое среды, куда проникает О₂ воздуха, на плотных или жидких средах в сосудах, закрытых ватно-марлевыми пробками или в чашках Петри.

При активной аэрации производят постоянное перемешивание культуры, что обеспечивает ее соприкосновение с воздухом; применяют при глубинном культивировании, когда микроорганизмы выращивают в больших объемах среды; чтобы обеспечить достаточное снабжение О₂ таких культур, их помещают в специальные качалки; если же объем среды больше 10 и 100 л (в реакторах), то через культуру продувают стерильный воздух;

в) создание бескислородных условий для анаэробов; для этого используются физические, химические и биологические методы, которые будут описаны далее.

5. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают в пробирках, чашках Петри, во флаконах с питательными средами. Время выращивания для большинства составляет 18-24 часа, но могут быть и отклонения, так Mycobacterium tuberculosis выращивают около 3-х недель.