6. Занятие № 4. Тема: культивирование вирусов, риккетсий и хламидий.

6.1. Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения. Задача 1. Описать способы культивирования вирусов.

Для этого надо знать:

1. Культивирование вирусов необходимо для диагностики инфекционных заболеваний, для изучения патогенеза и иммунитета, для получения диагностических и вакцинных препаратов.

2. Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты, поэтому их невозможно культивировать на искусственных питательных средах. Вирусы культивируют на уровне организма или в живых клетках. При этом используют клетки с повышенным метаболизмом.

3. Существуют три способа культивирования вирусов:

а) на лабораторных животных: применяют подкожный, интраназальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, субдуральный и др. методы заражения чувствительных к определенным вирусам животных: белых мышей (вирусы бешенства, энцефалита, гриппа), хорьков (вирусы гриппа), кроликов (вирус бешенства, натуральной оспы), обезьян (вирус полиомиелита); выбор метода зависит от тропизма вируса: например, респираторными вирусами заражают интраназально (закапывают вируссодержащий материал в нос), нейротропными – в головной мозг и т.д. Индикация (обнаружение) вируса проводится по развитию типичных признаков заболевания. На первых этапах развития вирусологии этот метод был единственным методом для изучения свойств и размножения вирусов. В наше время он используется для изучения патогенеза и иммунитета. Применение его ограничено, т.к. животные невосприимчивы к вирусам человека.

б) в куриных эмбрионах (метод Гудпасчура): исследуемый материал вводят в разные полости и ткани эмбриона; куриный эмбрион – очень удобный объект, т.к. защищен от попадания микроорганизмов из окружающей среды (стерильный) и других факторов; в нем отсутствуют скрытые вирусные инфекции; техника работы с ним проста; можно накопить большое количество вирусов. Но не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) способны размножаться в куриных эмбрионах; невозможно обнаружить микроб без предварительного вскрытия эмбриона; в нем очень много белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку микроорганизмов при изготовлении различных препаратов.

в) в тканевых культурах: для их приготовления используют самые различные ткани человека, животных, птиц; чаще всего – эмбриональные и опухолевые ткани, обладающие повышенной метаболической активностью. Метод выращивания различных клеток вне организма на искусственных питательных средах разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток, при этом для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную к нему культуру клеток и создать стандартные условия.

Задача 2. Описать культивирование вирусов в курином эмбрионе.

Для этого надо знать:

1. Для культивирования вирусов используют эмбрионы в возрасте от 8 до 12 дней. Для выращивания эмбрионов оплодотворенные яйца помещают в термостат при 38 С, в котором находится посуда с водой для создания влажности. Два раза в день яйца вынимают для проветривания. Периодически яйца просматривают в овоскоп на жизнеспособность. Живые эмбрионы отличаются подвижностью, пульсацией сердца, хорошо контурируемыми сосудами. Перед заражением эмбрион осматривают в овоскоп и намечают границы воздушного мешка, а также расположение зародыша.

2. Для предотвращения инфицирования эмбриона посторонними микробами заражение проводят в асептических условиях с использованием стерильного инструмента (ставят в стаканчик со спиртом) в помещении, облученном бактерицидными лампами. Скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70 % спиртом, обжигают, смазывают 2 % йодом, вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал обрабатывают антибиотиками для удаления бактериальной флоры.

3. Существует несколько способов заражения куриного эмбриона. Чаще всего материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку и в желточный мешок.

При заражении в аллантоисную полость в скорлупе над воздушной камерой проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц или скальпеля. Туберкулиновым шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Прокол в скорлупе заливают расплавленным парафином.

При заражении на хорион-аллантоисную оболочку ножницами вскрывается скорлупа над воздушной камерой, пинцетом приподнимается подскорлуповая оболочка и шприцем на оболочку наносят 0,2-0,5 мл вируссодержащего материала при вертикальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином.

Заражение в амниотическую полость осуществляется длинной иглой через отверстие в воздушной камере. Иглу вводят в темной комнате под контролем овоскопа. При попадании иглы в полость эмбрион сдвигается. Заражение приводит к непосредственному контакту вируса с тканями эмбриона, поэтому в данном случае вирус размножается не только в полости, но и в тканях зародыша.

При заражении в желточный мешок вируссодержащий материал вводят иглой длиной 3-4 см, которой проделывают отверстие в воздушной камере. Иглу ведут к центру с небольшим отклонением книзу при горизонтальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе запаивают каплей парафина.

После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37С.

4. Через 48-72 часа (срок максимального накопления вирусов) производят вскрытие зараженных эмбрионов. Перед вскрытием эмбрионы оставляют на ночь при 4 С. После обработки скорлупы спиртом и 2 % раствором йода ее рассекают ножницами немного выше очерченной карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так, чтобы избежать попадания скорлупы в полость. Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и рассматривают хорион-аллантоисную оболочку. Затем пастеровской пипеткой прокалывают эту оболочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают аллантоисную жидкость. После этого извлекают хорион-аллантоисную оболочку, дважды промывают физиологическим раствором, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.

5. О репродукции вируса судят по специфическому характеру поражений на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, по РГА – реакции гемагглютинации (склеивание эритроцитов).

Особенно четко очаги поражения на хорион-аллантоисной оболочке появляются в месте заражения в виде геморрагий, белесоватых очагов (вирус кори или гриппа вызывает образование оспин на оболочке).

По РГА устанавливают присутствие вируса в аллантоисной жидкости. РГА основана на способности некоторых вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов и, изменяя их поверхность, вызывать склеивание. РГА ставят на стекле или в пробирках: готовят двукратное разведение вируссодержащего материала, добавляют 1 % взвесь отмытых куриных эритроцитов и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 30-40 минут после оседания эритроцитов в контрольной пробе, в которую вместо вируссодержащего материала добавляют аллантоисную жидкость незараженного эмбриона. При гемагглютинации образуется зернистый осадок с фестончатыми краями, а в контроле – осадок в виде диска с ровными краями. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контроле указывает на присутствие вируса в исследуемой жидкости.