Задача 5. Охарактеризовать методы изучения протеолитической активности бактерий.

Для этого надо знать:

1. Протеолитическая активность – это способность микроорганизмов расщеплять белки с образованием различных продуктов (H₂S, NH₃, индола и т.д.). Изучение этих свойств применяется для идентификации бактерий.

2. Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: делают посев изучаемой культуры бактерий уколом в столбик мясопептонного желатина (МПБ + 10-20 % желатина) и оставляют при комнатной температуре (20-22 С) на несколько дней. Через 3-5-10 дней просматривают посевы и отмечают форму разжижения желатина, характерную для различных видов микробов – S. aureus вызывает воронкообразное разжижение; Bac. antracis и синегнойная палочка – послойное разжижение; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижать желатин способны микробы, выделяющие фермент типа коллагеназы;

б) по конечным продуктам распада белков: делают посев на МПБ и выдерживают в термостате при температуре 37С в течение 2-3 дней; для определения продуктов распада белков (индола, аммиака, сероводорода) используют специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ.

Индол обнаруживают по способу Мореля, для чего используют индикаторную бумажку, смоченную насыщенным раствором щавелевой кислоты, которая розовеет при образовании индола. Для обнаружения аммиака используют лакмусовую бумажку, в присутствии которого она синеет. Для обнаружения H₂S используют полоску фильтровальной бумаги, смоченную уксуснокислым свинцом, которая чернеет в присутствии H₂S. Образование H₂S связано с ферментацией серосодержащих аминокислот, чаще всего цистеина. Образование индола и аммиака связано с ферментацией триптофана, под влиянием фермента триптофаназы.

Микроорганизмы, расщепляющие казеин (белок молока), вызывают пептонизацию молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

Задача 6. Охарактеризовать использование микробных ферментов в медицине и пищевой промышленности.

Для этого надо знать:

1. Микробные ферменты широко используются в медицине. Из Aspergillus niger получают амилазу и протеазу; из Rhizopus - липазу; из Aspergillus orizae - диастазу, которые применяют для улучшения пищеварения. Из Streptococcus sp. получают стрептокиназу, а из Cl. histolyticum - коллагеназу, которые используют для заживления ран и ожогов.

2. Ферменты микроорганизмов используют в генной инженерии (рестриктазы и лигазы), а также в пищевой промышленности для получения уксусной, молочной и др. кислот, для получения молочнокислых продуктов, в виноделии.

Задача 7. Охарактеризовать методы выделения чистой культуры анаэробов. Для этого надо знать:

1. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий осуществляется в три этапа. При этом также получают чистую культуру из одной клетки и добиваются роста микроорганизмов в виде изолированных колоний с последующим ее пересевом.

2. Особенностью работы по выделению чистой культуры анаэробов является применение различных методов создания бескислородных условий (см. выше).

3. Три этапа заключаются в следующем:

Первый день. Исследуемый материал (земля, гной) засевают для накопления в среду Китта-Тароцци.

Второй день: а) просматривают посевы, приготавливают мазки и окрашивают по Граму (в положительном случае обнаруживают помутнение среды и пузырьки газа в ней, а также в мазках – крупные споровые грамположительные палочки); б) для получения изолированных колоний делают посев материала из среды Китта-Тароцци по методу Цейсслера, методу Вейнберга и методу Перетца.

Третий день: а) выросшие колонии изучают при помощи лупы и пересевают намеченную колонию в пробирку со средой Китта-Тароцци, которую помещают в термостат; б) проводят исследование чистой культуры анаэробов по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным признакам.

4. Посев по методу Цейсслера производят следующим образом: каплю (петлю) материала со среды Китта-Тароцци наносят на кровяной сахарный агар в первую чашку Петри и растирают шпателем по поверхности среды; затем этим же шпателем втирают материал в среду второй и третьей чашек для получения изолированных колоний. Посевы помещают в анаэростат или аппарат Аристовского. На следующий день по форме колоний (при рассматривании через лупу) и микроскопии мазков из них производят ориентировочное определение вида микроорганизмов и пересев отдельных, намеченных колоний на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры, изучения ее свойств и точного определения вида микроорганизмов.

5. Посев по методу Вейнберга производят следующим образом: одну или две капли (петли) материала из среды Китта-Тароцци вносят в пробирку с бульоном для разведения материала. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с предварительно прокипяченным (20 мин.) и остуженным до 50С сахарным МПА, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до самого дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей водопроводной воды. При этом агар застывает и фиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара.

Вместо узких пробирок могут быть использованы трубки Виньяля-Вейона. С их помощью можно произвести посев различных разведений почвенной взвеси для получения изолированных колоний. (Почвенную взвесь готовят следующим образом: к 1 г почвы прибавляют 100 мл стерильной воды в колбе на 250 мл, встряхивают на качалке 15 мин и отстаивают 5 мин; взвесь разбавляют в 10, 100 и 1000 раз, внося последовательно по 1 мл взвеси в пробирки с 9 мл стерильного 0,9 %-ного раствора NaCl.) В пробирки с 10 мл расплавленного и остуженного до 50С сахарного МПА засевают по 0,1 мл полученных разведений почвенной болтушки (10³, 10⁴, 10⁵),быстро перемешивают и засасывают в стерильные трубки Виньяля-Вейона. Посевы помещают в термостат при 37 С.

6. Посев по методу Перетца производится следующим образом. Вначале готовят разведения исследуемого материала: запаянную пастеровскую пипетку погружают в исследуемый материал (почва, гной и т.д.) и переносят сначала в 3 пробирки с физиологическим раствором (5-10 мл), а затем последовательно в 3 пробирки с расплавленным и охлажденным до 45-50 С агаром по 18-20 мл в каждой. Внеся пипетку в среду, делают ею 1-2 вращательных движения, чтобы смыть посевной материал. Содержимое пробирок быстро перемешивают пастеровской пипеткой и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых кладут стерильные стекла или спички, покрытые стерильными квадратными стеклами (6х6 см). Образуется капиллярная полость, куда быстро затекает расплавленный агар, и где создаются анаэробные условия.