Задача 3. Охарактеризовать методы идентификации бактериальных культур по биохимическим (ферментативным) признакам.

Для этого надо знать:

1. Ферментный состав микроорганизмов определяется геномом и является достаточно постоянным признаком, поэтому его определение важно для дифференциации и идентификации микроорганизмов. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

2. Различия в ферментном составе гидролаз определяют различия таких биохимических свойств бактерий, как: а) сахаролитические свойства – способность разлагать сахара; б) протеолитические свойства – способность расщеплять белки.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления: образование щелочей, H₂S, NH₃ при расщеплении белков; образование кислот, СО₂, Н₂ при сбраживании углеводов.

3. Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н₂О₂ с образованием водорода и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н₂О₂.

Цитохромоксидаза – фермент, обеспечивающий перенос электронов на кислород в процессе аэробного дыхания. Активность ЦО учитывается при дифференциации бактерий сем. Enterobacteriaceae. Для обнаружения ЦО полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом (1 % спиртовой р-р -нафтола и 1 % р-р N-диметил-р-фенилендиамин дигидрохлорида в соотношении 2:3) и наносят суточную культуру микроорганизмов. О наличии ЦО судят по синему окрашиванию.

4. Таксономическим признаком для микроорганизмов служит также способность восстанавливать нитраты в нитриты (для определения нитритов используют реактив Грисса), наличие бутандиолового брожения на среде Кларка, для выявления которого используется реакция Фогеса-Проскауэра на ацетоин – промежуточный продукт брожения.

Задача 4. Охарактеризовать методы изучения сахаролитических свойств бактериальных культур.

Для этого надо знать:

1. Сахаролитические свойства – это способность микроорганизмов ферментировать определенные углеводы с образованием органических кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО₂ и Н₂). Для многих микроорганизмов они служат таксономическим признаком.

2. Для определения сахаролитических свойств используются дифференциально-диагностические среды – жидкие и полужидкие среды Гисса.

В эти среды добавляют углеводы (лактозу, глюкозу, мальтозу и т.д.) и различные индикаторы. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – регистрируется также появление газообразных продуктов.

3. Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. При сбраживании сахара бактериями цвет среды в присутствии индикатора Андреде (интервал рН 7,2-6,5) изменяется от соломенно-желтого (первоначальный цвет) до ярко-розового (красного). Если кроме кислоты происходит также образование газа, он скапливается в поплавке. При отсутствии ферментации цвет среды не изменяется.

Поскольку определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, входящие в состав сред Гисса, то наблюдается довольно пестрая картина. Поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором был назван "пестрым рядом". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Используют короткий и длинный "пестрый ряд". К первому относятся среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и спиртом маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с моносахаридами (арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой и т.д.), полисахаридами (инулином, крахмалом, гликогеном и т.д.) и спиртами (глицерином, дульцитом, инозитом).

4. Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % МПА, 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды розовато-серый. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, а при наличии и газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, а сам агар разрывается.

Наиболее часто среды Гисса используют для дифференциальной диагностики бактерий кишечно-тифозной группы (для отличия патогенных представителей кишечно-тифозного семейства от нормальных представителей, например E. coli).

5. Для изучения бактерий кишечной группы широкое использование получили дифференциально-диагностические среды, содержащие лактозу – среды Эндо, Левина и Плоскирева. Благодаря наличию у E. coli фермента, расщепляющего лактозу, колонии этого микроба изменяют цвет среды в присутствии того или иного индикатора (на среде Эндо колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет; на среде Левина – в темно-фиолетовый, на среде Плоскирева – в красный). До посева бактерий индикатор фуксин в среде Эндо обесцвечен сульфитом натрия и находится в лейкосоединении. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид. Он взаимодействует с сульфитом натрия, рвется двойная связь, соединяющая его с фуксином, и фуксин восстанавливается.

6. Ферментация лактозы может быть изучена при посеве культуры на молоко: обезжиренное молоко подщелачивают 10 % р-ром карбоната натрия и добавляют в качестве индикатора лакмусовую настойку, разливают по пробиркам и стерилизуют дробным методом. При росте микробов на молоке можно наблюдать подкисление или подщелачивание, свертывание или пептонизацию.

7. Для обнаружения интенсивного кислотообразования, характерного для брожения смешанного типа, используют среду Кларка (1 % глюкоза, 0,5 % пептон, индикатор – метиленовый красный). При рН 4,5 и выше он имеет желтый цвет, при более низких значениях рН – красный цвет.

8. Микроорганизмы, образующие амилазу, способны расщеплять крахмал. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель р-ра Люголя. Если крахмал расщепляется, то цвет среды не изменяется. Если крахмал не расщепляется, среда с этим раствором дает синее окрашивание.