2. Исследование эффективности действия фотосенсибилизаторов на клетки дрожжей по их выживаемости:

В экспериментах используются дрожжи, выращенные при 32^оС на качалке (160 об/мин) в течение 5 часов (жидкая питательная среда – NH₄H₂PO₄ -2%, (NH₄)₂HPO₄ – 0,5%, K₂SO₄ – 0,2%, MgSO₄ – 0,2%, дрожжевой автолизат - 0,5% , сахароза – 1%), из клеток, смытых с суточного косяка (сусло-агар). Облучение суспензий дрожжей (~10⁶) проводится в минеральной среде вышеописанного состава с 1% сахарозы в стеклянных пробирках при комнатной температуре.

Подготовить к работе исследуемые (подвергаемые облучению в присутствии фотосенсибилизатора) пробы: добавить в пробу (1 мл суспензии клеток дрожжей) фотосенсибилизатор, а также соль (в экспериментах по исследованию влияния солей на эффективность фотодинамического действия фотосенсибилизатора) в необходимых концентрациях и провести инкубацию с добавками в течение 10 мин. Отобрать из пробы 50 мкл суспензии и провести посев на твердую среду (сусло-агар) в чашке Петри. Далее облучить пробу в течение 10 сек фотодиодом (или 60 сек ртутной лампой) 2-3 раза, после каждого периода облучения производя посев культуры. Подсчет выживаемости дрожжей произвести через сутки роста культуры при 32^оС методом микроколоний под микроскопом.

Рассчитать фототоксичность:

Т_ф = S_т - S_ф

где S_т и S_ф - выживаемость дрожжей до и после облучения соответственно.

Обработка результатов:

По результатам исследования фотодинамического действия различных фотосенсибилизаторов на клетки бактерий и дрожжей:

построить графики зависимости интенсивности биолюминесценции бактерий и выживаемости дрожжей (1- Т_ф) от дозы света D. Доза света определяется по формуле D(Дж/см²) = I(Вт/см²)*t(сек), где D – доза света, I - интенсивность света, t - время облучения. Определить параметр D₅₀ - дозу света, при которой достигается 50%-ое снижение интенсивности биолюминесценции бактерий или выживаемости дрожжей. Высчитать фоточувствительность ФЧ₅₀ как величину обратную D₅₀. Сравнить значения фоточувствительности для разных фотосенсибилизаторов.

По результатам исследования влияния солей на эффективность фотодинамического действия Холосенса:

построить графики зависимости интенсивности биолюминесценции бактерий и выживаемости дрожжей (1-Т_ф) от дозы света D. Для фиксированной дозы света определить параметр К:

К = (1-Т_ф)_соль/(1-Т_ф), где

(1-Т_ф)_соль - интенсивность биолюминесценции бактерий или выживаемость дрожжей для пробы, содержащей Холосенс и соль,

(1-Т_ф) - интенсивность биолюминесценции бактерий или выживаемость дрожжей для пробы, содержащей только Холосенс.

Вопросы для обсуждения:

1. Чем могут быть вызваны различия в эффективности фотодинамического действия разных фотосенсибилизаторов на определенную культуру клеток?

2. Чем могут быть вызваны различия в эффективности фотодинамического действия определенного фотосенсибилизатора на бактерии и дрожжи?

3. Какова взаимосвязь спектральных характеристик фотосенсибилизатора и источника излучения с фотодинамическим эффектом?

4. Какова зависимость фотодинамического эффекта от концентрации фотосенсибилизатора? С чем может быть связана нелинейность этой зависимости?

5. Как присутствие солей в среде влияет на эффективность фотодинамического действия? С чем могут быть связаны наблюдаемые эффекты?

6. Каковы различия эффектов одновалентных и двухвалентных солей? С чем могут быть связаны эти различия?

Литература:

• Макаров Д. А., Кузнецова Н. А., Южакова О. А., Савина Л. П., Калия О. Л., Лукьянец Е. А., Негримовский В. М., Страховская М. Г. Поликатионные фталоцианины цинка и алюминия: синтез, влияние степени замещения на физико-химические свойства и фотодинамическую активность в водной среде. Журнал физической химии. 2009. 83(6): 1183-1190.

• Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака - новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей. Соросовский образовательный журнал, 1996(8): 32-40.

• Рубин А.Б., Фрайкин Г.Я. Первичные молекулярные механизмы фотобиологических процессов и деструктивное действие оптического излучения. Успехи современной биологии. 1987. 103(3): 323-339.

• Страховская М. Г., Антоненко Ю. Н., Пашковская А. А., Котова Е. А., Киреев В., Жуховицкий В. Г., Кузнецова Н. А., Южакова О. А., Негримовский В. М., Рубин А. Б. Электростатическое связывание замещенных металлофталоцианинов с клетками энтеробактерий: роль в фотодинамической инактивации. Биохимия. 2009. 74 (12): 1603-1614.

• Alves E., Costa L., Carvalho C.M., Tomé J.P., Faustino M.A., Neves M.G., Tomé A.C., Cavaleiro J.A., Cunha A., Almeida A. Charge effect on the photoinactivation of Gram-negative and Gram-positive bacteria by cationic meso-substituted porphyrins. BMC Microbiol. 2009 15; 9: 70.

• Dougherty T.J., Gomer C.J., Henderson B.W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q. Photodynamic therapy. J. Natl. Cancer Inst. 1998 17; 90(12): 889-905. Review.

• Hamblin M.R., Hasan T. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? Photochem. Photobiol. Sci. 2004. 3(5): 436-50.

• Jori G., Fabris C., Soncin M., Ferro S., Coppellotti O., Dei D., Fantetti L., Chiti G., Roncucci G. Photodynamic therapy in the treatment of microbial infections: basic principles and perspective applications. Lasers Surg. Med. 2006; 38(5): 468-81.

• Maisch T., Szeimies R.M., Jori G., Abels C. Antibacterial photodynamic therapy in dermatology. Photochem. Photobiol. Sci. 2004; 3(10): 907-17.

• Wainwright M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). J. Antimicrob. Chemother. 1998. 42(1):13-28. Review.