Материалы и методы:

Объекты исследовании. Биосенсор "Эколюм" - лиофилизированный генно-инженерный штамм E.coli pXen7 (рис. 4);

штамм дрожжей Candida guilliermondii ВСБ-656 (культура получена во ВНИИсинтезбелок, Москва).

Фотосенсибилизаторы:

октакис-(холинил)замещенный фталоцианин цинка (ZnPcChol⁸⁺) – Холосенс; анионные тетракис-(сульфо)замещенный фталоцианин алюминия (AlPc^4-) - Фотосенс; метиленовый синий; профлавин ацетат; бенгальский розовый (красители синтезированы в ФГУП ГНЦ «НИОПИК»).

Соли: 1% растворы KNO₃, KCl, MgSO₄, CaCl₂

Люминометр “Биотокс-6” (Москва) с набором кювет объемом 1,5 мл для измерения интенсивности биолюминесценции биосенсора "Эколюм". Принцип действия прибора основан на регистрации слабых световых потоков с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ), работающего в режиме счета анодных импульсов. Область максимальной спектральной чувствительности ФЭУ располагается в диапазоне 380-490 нм.

Ход работы:

Для проведения исследования по сравнению эффективности действия различных фотосенсибилизаторов на бактерии и клетки дрожжей необходимо добавить в соответствующие пробы:

№ 1, 2 - 0,5 и 1 мкМ Холосенса;

№ 3, 4 - 1 и 5 мкМ Фотосенса;

№ 5, 6 - 0,5 и 1 мкМ метиленового синего;

№ 7, 8 - 0,5 и 1 мкМ профлавина ацетата;

№ 9, 10 - 5 мкМ и 10 мкМ бенгальского розового.

Облучение проб №1-10 проводить ртутной лампой с фильтром БС-8.

Для проведения исследования влияния солей на эффективность фотодинамического действия положительно заряженного фотосенсибилизатора на бактерии и клетки дрожжей в каждую пробу необходимо добавить 0,5 мкМ Холосенса и следующие соли:

№ 1 – без соли;

№ 2, 3 - 0,1 и 0,5% KNO_3;

№ 4, 5 - 0,1 и 0,5% KCl;

№ 6, 7 - 0,01 и 0,1% MgSO₄;

№ 8, 9 - 0,01 и 0,1% CaCl₂;

Облучение проб № 1-10 проводить фотодиодом (684 нм).

1. Исследование сравнительной эффективности действия различных фотосенсибилизаторов на бактерии методом биолюминесценции.

Методика основана на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма бактерий при воздействии токсических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем.

Хемилюминесцентная реакция, непосредственно сопровождаемая свечением, катализируется ферментом — бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н2 до ФМН и одновременно - алифатического (С14) альдегида до миристиновой (С14) кислоты. Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида:

 ФМН-H₂ + E + O2E-ФМН-H₂-OOH

RCHO-E-ФМН-H₂-OOHRCOOH + E-ФМН-HOH*

 RCOOH + E + ФМН + H₂O + фотон (490 нм)  

Здесь E - люцифераза, OOH - гидроперекисная группа, RCOH - алифатический альдегид, RCOOH - жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида.

Подготовка тест-объекта "Эколюм":

Регидратировать лиофилизированные бактерии в 20 мл дистиллированной воды. Колбу с полученной суспензией бактерий несколько раз встряхнуть. Довести температуру суспензии бактерий до комнатной температуры (15-25°С) и выдержать суспензию в этих условиях 1,5-2 часа. Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии бактерий перед отбором проб для исследования.

Определение рабочей концентрации биосенсора "Эколюм":

Измерить фоновое значение сигнала прибора "Биотокс" за 10 сек без кюветы. Добавить 1 мл суспензии бактерий из колбы в кювету люминометра. Снять крышку кюветного отделения, повернув ее против часовой стрелки до упора. Установить пробирку с образцом биосенсора в кюветное отделение. Закрыть кюветное отделение крышкой, повернув ее по часовой стрелке до упора. Прибор при этом приводится в рабочее состояние (открывается оптический канал между биосенсором и ФЭУ). Измерить величину интенсивности биолюминесценции за 10 сек.

Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающим фоновое значение прибора в 25-250 раз. Если обнаруженная величина меньше интервала, следует увеличить добавку биосенсора и повторить измерение. Если величина больше интервала, следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

Определение токсичности фотосенсибилизаторов в анализируемых пробах.

Подготовить к работе исследуемые (подвергаемые облучению в присутствии фотосенсибилизатора) пробы: добавить в пробу (1 мл суспензии бактерий) фотосенсибилизатор, а также соль (в экспериментах по исследованию влияния солей на эффективность фотодинамического действия фотосенсибилизатора) в необходимых концентрациях и провести инкубацию с добавками в течение 10 мин. Измерить интенсивность биолюминесценции после инкубации. Облучить пробу в течение 30 сек фотодиодом (или 60 сек ртутной лампой) после чего измерить интенсивность ее свечения. Повторять облучение пробы по 30 (или 60) сек, пока уровень свечения не составит ~10% от исходного значения.

Рассчитать значение темновой токсичности фотосенсибилизатора по формуле:

Т_т=100(I_о-I_т)/ I_о,

где I_о и I_т – интенсивность свечения пробы до и после инкубации с добавками соответственно.

Критерием фототоксического действия является изменение интенсивности биолюминесценции биосенсора в пробе после облучения по сравнению с интенсивностью биолюминесценции той же пробы, препроинкубированной с фотосенсибилизатором, до облучения. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально фототоксическому эффекту, количественная оценка которого выражается в виде безразмерной величины - индекса фототоксичности "Т", определяемого следующим образом:

Т_ф=100(I_т-I_ф)/ I_т,

где I_т и I_ф - интенсивность свечения пробы до и после облучения соответственно.