Основные этапы анализа хромосом

Существует множество модификаций пря­мого и непрямого методов приготовления хро­мосомных препаратов. Однако при всем их разнообразии основные этапы получения мета-фазных пластинок, пригодных для анализа, остаются неизменными.

1. Использование колхицина или других аген­тов — ингибиторов образования веретена, оста­навливает клеточный цикл на стадии метафазы.

2. Гипотоническая обработка — вызывает набухание клетки, разрушение межхромосом­ных связей, что способствует отделению хромо­сом друг от друга.

3. Фиксация — сохраняет структуру хромо­сом и удаляет остатки цитоплазмы.

4. Окрашивание препаратов.

Исключением можно считать приготовление препаратов мейотических хромосом (сперматоциты I на стадии пахитены и ооциты II на ста­дии метафазы), которые не требуют применения колхицина. Первые три этапа полностью могут быть исключены при анализе Х- или Y-полового хроматина в интерфазных ядрах буккального эпителия и хориона.

Применение всех этапов обработки материа­ла существенно улучшает качество препаратов мета фазных хромосом. Концентрации реаген­тов, температурные и временные режимы, спо­собы нанесения материала на препарат и ок­раски хромосом могут варьировать. Наличие многочисленных вариантов и модификаций цитогенетических методов объясняется особеннос­тями исследуемого материала, целями исследо­вания и устоявшимися лабораторными тра­дициями. Подробно методы приготовления и анализа хромосомных препаратов изложены в соответствующих руководствах [3, 10, 17, 27].

Краткая характеристика методов анализа хромосомных препаратов

В зависимости от задач исследования пре­параты хромосом можно анализировать одним из следующих способов.

1. Анализ с помощью фазового контрас­та позволяет оценить митотический индекс и ка­чество метафазных пластинок на препарате.

2. Сплошное (рутинное) окрашивание хромо­сом применяется для анализа численных аномалий кариотипа (гетероплоидии) и при специальных исследованиях хромосомных аберраций (хромосомных и хроматидных разрывов, мостов и фрагментов).

3. Дифференциальное окрашивание хромо­сом используется для детального анализа кариотипа, оно позволяет идентифицировать каж­дую хромосому или ее отдельный сегмент. Спо­собы детекции дифференциальной сегментации хромосом могут быть различны. Основные типы окраски, наиболее широко используемые в цитогенетической практике: G-, Q-, R-, С-, RBA-,FPG-, Ag-NOR, DA/DAPI.

4. Гибридизация in situ является одним из современных методов молекулярно-цитогенетического анализа. Метод состоит в использова­нии хромосом-специфических ДНК-зондов, их гибридизации на хромосомных препаратах и детекции сигнала с помошью светового или люминесцентного микроскопа. Преимущества это­го метода и особенно его неизотопного вариан­та — флуоресцентной гибридизации (FISH) -заключаются в возможности детального анали­за кариотипа при невысокой митотической ак­тивности и качестве метафазных хромосом на препарате, а также анализа анеуплоидии на ин­терфазных ядрах. Метод FISH особенно важен для изучения хромосомного мозаицизма и для точной идентификации структурных перестроек и генеза маркерных хромосом.

Детальное описание основных методов диф­ференциальной окраски хромосом и метода гиб­ридизации in situ приведено в соответствующей литературе [3, 10, 17, 27]. Некоторые модифика­ции методов цитогенетического анализа рас­смотрены в томе 2 данного издания.