Вопросы генной инженерии. Создание и использование рекомбинантных днк

Генная инженерия – система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде рекомбинантных или гибридных ДНК.

Методы создания рекомбинантных днк

1. Расщепление ДНК рестриктазами. В качестве мишеней рестриктаз выступают палиндромы из 4-6 пар оснований. Это сайты рестрикции. Одни рестриктазы вносят разрывы по оси симметрии, и образуются «тупые» концы», другие – со сдвигом, образуются «липкие» концы (фрагменты имеют на концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в 4 нуклеотида). Полученные фрагменты используют для создания рекомбинантных ДНК.

2. Секвенирование нуклеотидов. Фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, отделяют электрофорезом и исследуют каждый из них отдельно. Строят рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.

3. Конструирование рекомбинантной ДНК. Плазмиды выделяют из E.coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК с помощью рестриктаз. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате образуются «липкие» концы. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу. Если смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединяются «липкими» концами. Далее с помощью лигаз вновь получают кольцевую молекулу ДНК, которая вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это рекомбинантная ДНК.

Возможны:

- сшивка по одноименным «липким» концам (рестриктазно-лигазный метод) – комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований; для восстановления разрывов используют ДНК-лигазу;

- сшивка по «тупым» концам (коннекторный метод) – тупые концы соединяют ДНК-лигазой, при этом эффективность реакции меньше, чем при сшивке «липкими» концами;

- сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами – применяют линкеры, т.е. химически синтезированные олигорибонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию (существуют линкеры «тупой конец – липкий конец»); так получают очень небольшие количества рекомбинантной ДНК.

4. Клонирование (размножение) рекомбинантной днк:

- клонирование ДНК in vivo: к культуре E.coli добавляют рекомбинантные плазмиды, которые включаются в бактериальные клетки, и получают рекомбинантные буктерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий выделяют клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них – исследуемый фрагмент ДНК. Так выделяют ген или любой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей;

- аплификация (увеличение числа копий) ДНК in vitro: в 1985 г. К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, получивший название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке два синтетических праймера. Праймеры ориентированы так, чтобы синтез с помощью полимеразы протекал только между ними. Тем самым происходит удвоение копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок называют «ампликоном». Амплификация заключается в повторяющихся циклах и является трехступенчатым процессом: 1 – денатурация ДНК при 95 С; 2 – отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60 С); 3 – достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при 70-75 С. Продолжительность указанного цикла – менее 3 минут. Т.е., за 2 часа получают около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК.

Применение ПЦР в медицинской практике – диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания (в частности, для ранней диагностики ВИЧ); для анализа индивидуальных сперматозоидов и пр.

5. Введение гена в клетку.

Ген водят двумя способами так, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, и интегрировался с геномом клетки.