1.5. Гибридизация нуклеиновых кислот
Методы гибридизации основаны на комплементарном спаривании оснований между одноцепочечными нуклеиновыми кислотами. Этот метод позволяет идентифицировать специфические последовательности ДНК в сложных смесях. Для этого одну молекулу нуклеиновой кислоты каким-либо путем метят для облегчения детекции, а затем используют в качестве зонда для поиска специфической (комплементарной) последовательности-мишени. Например, при блот-гибридизации по Саузерну (саузерн-блоттинг) геномную ДНК расщепляют на фрагменты, разделяют электрофорезом в агарозном геле, переносят на мембрану и фиксируют, создавая отпечаток геля. Затем ДНК денатурируют (для разделения цепей) и добавляют зонд. Зонд гибридизуется со специфической последовательностью-мишенью, и его положение на мембране может быть выявлено в виде полосы после определения метки. Аналогичную процедуру можно использовать для идентификации специфических молекул РНК в смесях после электрофоретического разделения последних (нозерн-блот-гибриди-зация) или в образцах тканей, зародышах или эксплантатах in situ (гибридизация in situ). Гибридизация используется также для идентификации клонов при скрининге библиотек (гибридизация на колониях или фаговых бляшках).
Традиционно в ДНК- и РНК-зонды вводят радиоактивную метку, которую детектируют радиоавтографией (накладывание чувствительной к радиоактивному излучению пленки) или с помощью «фосфоимиджера» (исполь зование чувствительного к радиоактивному излучению экрана). Однако радиоактивные метки постепенно вытесняются нерадиоактивными, такими как флуорофоры, ферменты, которые можно детектировать колориметрическими методами, флуоресцентные субстраты или гаптены (которые можно определять с помощью антител). Какая бы метка ни использовалась, процедура ее введения подразумевает синтез ДНК или РНК с участием нуклеотидных аналогов.
Рис. 10. Метод Саузерн-блоттинга. Сложную смесь молекул ДНК (кДНК, расщепленная геномная ДНК), содержащую интересующую последовательность, подвергают электрофоретическому разделению и переносят на мембрану капиллярным блоттингом. Для этого на поверхность геля помещают мембрану, затем сверху плотно прижимают несколько слоев фильтровальной бумаги, так что буфер, проходя через мембрану, одновременно переносит на нее ДНК. Обычно используют щелочной буфер, так что ДНК денатурирует на отдельные цепи. Иммобилизованную ДНК гибридизуют с меченым зондом, узнающим целевую последова-тельность. В результате детекции на мембране обнаруживают единственную полосу или набор полос, соответствующих только интересующим фрагментам ДНК.
Гибридизация in situ позволяет определить, в каком сегменте хромосомы расположен соответствующий маркер. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) позволяет одновременно картировать несколько различно окрашенных маркеров ДНК, а гибридизация в период интерфазы - определить порядок маркеров в отдельных участках хромосомы. С помощью этого метода удается надежно выявить хромосомные аномалии
Препараты фиксированных хромосом гибридизуют (инкубируют при повышенной температуре с последующим охлаждением) с исследуемыми последовательностями нуклеотидов, меченными радиоактивной, флуоресцентной или иной меткой. После отмывания несвязавшейся метки оставшиеся меченые молекулы нуклеиновых кислот оказываются ассоциированными с участками хромосом, содержащими последовательности, комплементарные исследуемым меченым последовательностям нуклеотидов. Полученные гибриды анализируют с помощью микроскопа либо непосредственно, либо после авторадиографии. Для этой группы методов характерна более высокая разрешающая способность, чем для гибридизации соматических клеток , поскольку они позволяют локализовать изучаемые последовательности нуклеотидов на хромосомах.