МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Национальный исследовательский университет

Новосибирский государственный университет

Факультет естественных наук

Задания к семинарским занятиям по молекулярной биологии

Курс 2–й, IV семестр

Учебно - методическое пособие

Новосибирск 2012

Предлагаемое учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-го курса биологического отделения факультета естественных наук и медицинского факультета. Оно содержит: краткое описание базовых молекулярно-биологических методов, примеры решения задач и задачи для самостоятельного решения, справочные таблицы.

В данном пособии используются материалы из следующих источников:

Уилсон Дж., Хант Т. Молекулярная биология клетки: Сборник задач: Пер. с англ. - М.: Мир, 1994

В. М. Глазер А. И. Ким, Н. Н. Орлова, И. Г. Удина, Ю. П. Алтухов. Задачи по современной генетике. Книжный дом "Университет". 2008

С. Примроуз, Р. Тваймен Геномика. Роль в медицине. Бином. Лаборатория знаний. 2008.

М. Сингер, П. Берг Гены и геномы (в 2-х томах) М. Мир. 1998

 Мусил Я., Новикова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах - М.: Мир, 1984

Коничев А.С., Цветков И.Л., Попов А.П., и др.Практикум по молекулярной биологии. М.: КолосС, 2012

Wilson J, Hunt T. Molecular Biology of the Cell 5E - The Problems Book. NY. Garland Science - Taylor & Francis Group. 2008.

Составители: Доцент Колесникова Т.Д., ассистент Зайцева О.О.

Учебно-методическое пособие подготовлено в рамках реализации Программы развития НИУ-НГУ

© Новосибирский государственный университет, 2012

Часть 1. Методы молекулярной биологии

1.1 Электрофоретическое разделение фрагментов днк

Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК, таких как выделение, рестрикция, ПЦР, молекулярное клонирование, наиболее часто используют электрофорез.

Электрофорез – метод разделения макромолекул (в том числе молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза – горизонтальный и вертикальный.

Рис. 1. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле.

Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя, например бромида этидия.

Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода к аноду. На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов. Агарозный гель – пористая структура, и увеличение концентрации агарозы в геле приводит к уменьшению размеров его пор и, соответственно, к снижению скорости движения макромолекул сквозь гель. Увеличение напряженности электрического поля ускоряет движение молекул. Заряд молекулы увеличивается пропорционально ее длине, но при этом пропорционально длине увеличивается и ее масса. Поэтому ключевым фактором, определяющим скорость движения молекул в геле является способность молекул «протискиваться» через поры геля. Разделение молекул основано на том, что электрофоретическая подвижность молекулы ДНК снижается с увеличением ее длины. Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с одинаковой скоростью. Подвижность суперспирализованных и просто кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера.

П ри постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в один из карманов геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с известными значениями молекулярных масс – как правило, это ДНК известной плазмиды или фага, порезанная определенной рестриктазой, но это могут быть и искусственно синтезированные фрагменты).

Рис. 2. Один из стандартных маркеров молекулярного веса (плазмида pR322, рестриктаза BsuR I).

Рис. 3 Электрофоретический гель, окрашенный бромидом этидия. На левой дорожке нанесен маркер молекулярного веса

Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например, бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.

Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в двуцепочечные молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания электрофореза гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254-400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра, при этом становится видна ДНК.

Для вертикального гель-электрофореза используют полиакриламидный гель (ПААГ). Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.