Работа 2. «Разделение белков методом электрофореза»
Принцип метода. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).
Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле (ПААГ) и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам. Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины. Электрофорез тех же белков в ПААГ позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.
Клинико-диагностическое значение: При многих заболеваниях очень часто изменяется процентное соотношение отдельных белковых фракций, хотя общее содержание белка в сыворотке крови остается в пределах нормы. Такое состояние носит название диспротеинемия. Низкий уровень альбумина (гипоальбуминемия) может возникать из-за нефритического синдрома, болезни печени, ожогов, голодания и др. Повышение уровня γ-глобулинов говорит о наличии в организме инфекции и воспаления, снижение может свидетельствовать об иммунодефиците. Повышение уровня α –глобулинов наблюдается при острых воспалительных процессах.
Работа 3. «Тимоловая проба»
Тимоловая проба, предложенная в 1944 году Маклаганом. Проба является положительной при уменьшении альбуминов и увеличении β- и γ-глобулинов, которые образуют глобулин-тимол-липидные комплексы ( 40%- глобулинов, 32%- тимола, 18%- холестерина, 10%- фосфолипидов), что является причиной помутнения раствора.
Принцип метода: патологически повышенные β - и γ-глобулины и липопротеиды осаждаются из сыворотки крови при рН = 7,55 буферном раствором, насыщенным тимолом. Измеряют интенсивность помутнения, зависящую от содержания белковых фракций и их количественного соотношения.
Порядок определения: в пробирку вносят пипеткой 3 мл рабочего раствора, добавляют 0,05 мл сыворотки, перемешивают и оставляют стоять ровно 30 мин. Потом содержимое пробирки вновь перемешивают и измеряют оптическую плотность на ФЭКе (кювета - 10мм, длина волны – 620-660мм).
Интерпретация результатов:
Нормальные величины 0-4 единиц помутнения (S-Н).
Границы нормы 4-5 единиц помутнения (S-Н).
Патологические величины – > 5 единиц помутнения (S-Н).
Клинико-диагностическое значение: Проба позволяет диагностировать «синдром воспаления» при поражении печёночной паренхимы. Тимоловая проба положительна в 90-100% случаев токсического, инфекционного (вирусного) гепатита ещё в преджелтушной стадии заболевания и при безжелтушной его форме. При механической желтухе проба отрицательна. На этом основано использование теста при дифференциальной диагностике желтух. У пациентов, перенесших инфекционный гепатит, показатели тимоловой пробы сохраняются повышенными на протяжении 6 мес после выписки из стационара. Поэтому этот тест наряду с определением уробилина в моче можно использовать и в период диспансерного наблюдения за больными с данной патологией.