Хід роботи

1. Взяти з середовища Сабуро або Сусло бактеріологічною петлею колонію дріжджів і виготовити мікропрепарат, який зафарбувати за Грамом.

2. Замалювати культуру дріжджів у протокол лабораторного дослідження.

Питання для самоконтролю

1. Яке місце у систематиці живих організмів займають незавершені та плісеневі гриби, дріжджі?

2. Яка спільна морфологія плісеневих та незавершених грибів?

3. Охарактеризуйте головні роди плісеневих грибів та окремих їх представників?

4. Які Ви знаєте роди незавершених грибів? Назвіть головні роди і представників?

5. Яка будова еукаріотичної клітини на прикладі дріжджів?

6. Які способи розмноження характерні для дріжджів?

7. Охарактеризуйте роди і види дріжджів, які мають значення у харчових виробництвах та у біотехнології?

Лабораторна робота №5

Тема: Живильні середовища для культивування мікроорганізмів. Виготовлення живильних середовищ для мікроорганізмів

Мета роботи. Вивчити класифікацію і призначення живильних середовищ. Навчитися готувати м’ясопептонний бульйон (МПБ) і м’ясопептонний агар (МПА) та інші поживні середовища.

Об’єкт та матеріали. Сухий агар-агар, МПА, МПБ, середовище Ендо, Кеслер, Лактобакагар, Сабуро, фарш яловичий, хімічно чиста кухонна сіль, рН-індикатори, термостійкі колби, електрична плитка.

Завдання

1. Ознайомитися з технікою приготування МПБ, МПА та середовищ, які випускає промисловість.

1. Приготувати середовища: МПА, МПБ, Ендо, Кеслер, Лактобакагар, Сабуро, звернути увагу на колір, консистенцію, рН.

Теоретична основа

У лабораторних умовах мікроорганізми культивують на живильних середовищах, які повинні мати всі речовини, необхідні для їх росту.

Конструктивні і енергетичні процеси у мікроорганізмів дуже відрізняються. Тому так само відрізняються їх потреби у живильних речовинах. Універсальних середовищ, однаково придатних для росту всіх без винятку мікроорганізмів, не існує. Відомо дуже багато живильних середовищ (ще в 1930 р. було класифіковано більше 2000 середовищ). В той же час число інгредієнтів, які становлять основу живильних середовищ, невелике.

Основними компонентами будь-якого поживного середовища для культивування мікроорганізмів є сполуки вуглецю і азоту. Вони і визначають специфічність більшості живильних середовищ.

Автотрофні мікроорганізми можуть використовувати вуглекислоту як єдине джерело вуглецю, тому в середовище вносять гідрокарбонат натрію або продувають повітря, збагачене вуглекислим газом.

Гетеротрофні мікроорганізми здатні використовувати різні вуглецьвмісні органічні сполуки – кислоти, спирти, вуглеводи, ароматичні сполуки тощо.

Потреби мікроорганізмів в азоті задовольняються за рахунок азотовмісних сполук, в яких азот має різний ступінь окислення (амонійні солі, нітрати, амінокислоти і молекулярний азот, а інколи білки та пептони).

Багато мікроорганізмів потребує наявності в середовищі так званих факторів росту (вітамінів, пуринів, піримідинів, амінокислот), які додають до середовища у вигляді чистих сполук чи у складі дріжджового або кукурудзяного екстрактів.

Класифікація живильних середовищ

Універсальні: ПВ, МПБ, МПА Спеціальні: цукровий МПА, МПБ, сироватковий МПА, кров’яний МПА Елективні: 1% лужна ПВ Селективні: Середовище Мюллера, фуразолідоно-твіновий агар, Сабуро, Сусло, Кеслер, Кода, Лактобакагар, Біфідум, Ентерококагар. Диференціально-діагностичні: для визначення цукролітичних властивостей (середовища Гіса, Ендо, Левіна, Плоскірева) для визначення протеолітичних властивостей (згорнута сироватка, МПЖ, молочне) для визначення пептолітичних властивостей (МПБ, ПВ) для визначення гемолітичних властивостей (кров’яний МПА) для визначення редукуючих властивостей (середовища з різними барвниками)

Крім джерел вуглецю та азоту і факторів росту для побудови речовин клітині необхідні сірка, фосфор та інші елементи, а також мікроелементи. Всі вони повинні входити до складу поживного середовища у доступній для мікроорганізмів формі. Останнім етапом у приготуванні поживного середовища є доведення рН розчину до необхідного. За складом прийнято розрізняти натуральні або природні середовища складу, який погано піддається стандартизації, і синтетичні середовища.

За консистенцією розрізняють рідкі, сипкі і тверді середовища.

Рідкі середовища широко застосовують для накопичення біомаси чи продуктів обміну мікроорганізмів, для підтримки і збереження колекції культур мікроорганізмів, які погано розвиваються на твердих середовищах.

Сипкі середовища застосовують у мікробіологічній промисловості для культивування деяких продуцентів фізіологічно активних сполук, нарощування міцелію грибів. До таких середовищ відносять розварене пшоно, висівки, ячмінь, пшеницю, жито тощо.

Тверді середовища використовують для виділення чистих культур, з діагностичною метою для опису колоній, характеру росту мікроорганізмів, для визначення кількості мікроорганізмів, їх біологічної активності, для збереження культур у колекціях тощо. Для ущільнення середовищ використовують агар або желатин.

Залежно від потреб бактеріологів живильні середовища поділяються на п’ять основних груп.

Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать м’ясопептонний бульйон (МПБ) та м’ясо-пептонний агар (МПА). За своїм складом, наявністю живильних речовин вони придатні для культивування багатьох видів бактерій.

Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належить кров’яний, молочний, сироватковий агари, сироватковий бульйон.

Третя група – елективні середовища, на яких мікроорганізми певного виду ростуть швидше, більш інтенсивно, опереджають у своєму розвитку інші види бактерій. Наприклад, 1 % лужна пептонна вода є елективним середовищем для холерних вібріонів.

Четверта група - селективні середовища, які завдяки додаванню певних компонентів (жовч, фарби, антибіотики та ін.) здатні пригнічувати розвиток одних видів мікроорганізмів, але не впливають на інші види. так, середовище Кеслер і Кода є селективним для бактерій групи кишкових паличок, жовчний агар для ентерококоів, лактобакагар для лактобактерій, біфідум для біфідобактерій. Додавання антибіотиків до складу середовищ робить їх селективними для грибів (напр. середовище Сабуро та ін.).

П’ята група – диференціально–діагностичні середовища. Це велика група середовищ, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей (середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, Гісса).

Агар складний полісахарид, якій отримують з морських водоростей. Він здатний утворювати гелі, які плавляться при температурі приблизно 100°С і стають твердими при 45°С. Агар не розщеплюється під дією більшості мікроорганізмів. За необхідності його можна використовувати кілька разів після кілька кратного промивання дистильованою водою і наступного фільтрування.

Желатин – білок, який отримують виварюванням кісток, хрящів, сухожиль, луски. Желатин плавиться при температурі 25°С, яка нижча за звичайну температуру інкубації багатьох мікроорганізмів (30-37 °С). Ця властивість желатину обмежує його застосування для ущільнення середовища. Желатин використовують, головним чином, для виявлення протеолітичної активності мікроорганізмів. Його додають до рідких середовищ у кількості 15-20%.

Желатинові середовища стерилізують при 0,5 атм 15 хв.

Поживні середовища для культивування анаеробів: цукровий агар стовпчиком, цукровий бульйон, молоко за Тукаєвим, середовище Кітта-Тароцці, середовище Вільсон-Блера, агар Цейсслера.

Культивування анаеробів проводять в безкисневих умовах. Відношення до кисню можна визначити при посіві культури уколом в стовпчик агару. Аероби виростуть на поверхні стовпчика, ріст анаеробів відбувається в глибоких шарах поживного середовища. Мікроорганізми проміжної групи (факультативні анаероби) ростуть як на поверхні середовища, так і в глибині нього.

Середовище Кітта-Тароцці (для анаеробів) – це поживний бульйон з глюкозою та шматочками свіжих органів тварин. Глюкоза та шматочки органів мають редукуючу властивість. Зверху середовище заливають шаром стерильної олії.