Фазово-контрастная микроскопия

Световые волны характеризуются длиной волны, ам­плитудой и фазой. Глаз человека способен различать длину волны (цвет) и амплитуду (интенсивность, яркость света), но не может обнаружить различия в фазе.

При микроскопии окрашенных объектов наблюдается изменение амплитуды (уменьшение яркости света) и изби­рательное поглощение света определенной длины волны (изменение цвета).

При наблюдении неокрашенных микроорганизмов, от­личающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. По этому глаз изменений заметить не может, и эти объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на превращении фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом биологическом микроскопе и состо­ит из:

1) набора объективов со специальными фазовыми пластинками;

2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответству­ющие фазовым пластинкам в каждом из объективов;

3) вспомогательного микроскопа.

Настройка фазового контраста, в основном, заключает­ся в следующем:

1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазово-контрастные;

2. устанавливают объектив малого увеличения и отвер­стие в диске конденсора без кольцевой диафрагмы (обоз­наченное цифрой «О»);

3. настраивают свет по Кёлеру;

4. выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

5. поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

6. вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре точно совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавли­вают окуляр.

Рис.3 Cхема фазово-контрастного устройства.

Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается, и они выглядят тошными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). Наша промышлен­ность выпускает устройство КФ-4 для позитивного фазо­вого контраста.

Фазово-контрастная микроскопия широко применяется! Также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики — так называемые ин­вертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор — сверху. Иногда они заключены в термостат для наблюдения за динамикой изменений в клетках культуры ткани и снабже­ны кинокамерой.

Морфология некоторых микроорганизмов не может быть изучена с помощью описанных выше способов микроскопии. К ним относятся различные спирохеты и, в частности, лептоспиры, некоторые крупные вирусы. Для наблюдения этих микроорганизмов применяют темнопольную микроскопию.