- •Введение
- •Микроорганизмов
- •1. Принципы систематизации и классификации микробов.
- •2. Идентификация микроорганизмов
- •3.1.2. Определение чистоты выделенной культуры.
- •3.1.3. Культуральные признаки.
- •А. Рост на плотных питательных средах.
- •Б. Рост на жидких питательных средах.
- •Б. Окраска препарата по Граму.
- •3.2.2. Методы исследования живых клеток. А. Препарат «раздавленная капля»
- •Б. Препарат «висячая капля».
- •В. Препарат «отпечаток»
- •3.2.3. Цитохимические методы исследования строения микробов а. Окраска капсул и приготовление красителей а) Окраска капсул
- •Б) Приготовление красителей для окраски капсул.
- •Б. Определение кислотоустойчивости бактерий.
- •В. Окраска спор и приготовление реактивов. А) Окраска спор
- •Б) Реактивы для окрашивания спор бактерий
- •Г. Окраска жгутиков а) Приготовление препарата
- •Б) Методы окрашивания.
- •В) Реактивы для окраски жгутиков.
- •Д. Окраска включений клеток микроорганизмов
- •Препараты для окрашивания включений.
- •Е. Выявление нуклеоида и приготовление реактивов а) Методы выявления
- •Б) Реактивы для выявления нуклеоида.
- •3.3. Определение физиолого-биохимических характеристик.
- •3.3.1. Отношение к кислороду
- •3.3.2. Отношение к температуре
- •3.3.3. Тест на окисление-брожение, или тест Хью-Лейфсона
- •3.3.4. Отношение к углеводам и пятиатомным спиртам
- •Д. Ввыявление индола и применяемые реактивы. А) Методы выявления
- •Б) Применяемые реактивы.
- •Е. Определение ферментов бактерий. А) Определение липазы
- •Б) Определение каталазы.
- •Ж. Выявление способности бактерий восстанавливать нитраты в нитриты.
- •З. Определение интенсивности кислотообразования.
- •И. Выявление аммиака.
- •1. Грамотрицательные формы
- •1.1. Грамотрицательные бактерии, не образующие спор
- •1.1.1. Скользящие бактерии
- •1.1.2. Почкующиеся и (или) стебельковые бактерии
- •1.1.3. Извитые бактерии
- •1.1.4. Спиральные и изогнутые бактерии
- •1.2. Грамотрицательные аэробные палочки
- •1.3. Крупные овальные или палочковидные клетки, свободноживущие аэробные азотфиксаторы
- •1.4. Бактерии, использующие метан и метиловый спирт
- •1.5. Солелюбивые палочки и кокки
- •1.6. Роды с неясным систематическим положением (аэробные овальные кокки и палочки)
- •1.7. Факультативно-анаэробные палочки
- •1.8. Роды с неясным систематическим положением
- •1.9. Грамотрицательные кокки и коккобациллы
- •1.10. Грамотрицательные анаэробные кокки
- •1.11. Грамотрицательные аэробные хемолитотрофные бактерии
- •1.12. Грамотрицательные облигатно-анаэробные палочки, образующие метан
- •1.13. Риккетсии
- •1.14. Микоплазмы
- •2. Грамположительные формы
- •2.1. Грамположительные аспорогенные палочковидные бактерии
- •2.2. Палочки и (или) коккобактерии аэробы или микроаэрофилы неясного систематического положения
- •2.3. Палочки и кокки, образующие эндоспоры
- •2.4. Грамположительные кокки
- •2.5. Актиномицеты и родственные им организмы
- •2.5.1. Секция 1. Паразиты и патогены человека и животных.
- •2.5.2. Секция II. Фитопатогенные бактерии
- •2.5.3. Секция III. Непатогенные каринобактерии
- •2.6. Бактерии с многогнездовыми спорангиями
- •2.7. Актинопланы
- •2.8. Стрептомицеты
- •Список литературы
- •Оглавление
2. Идентификация микроорганизмов
Термин «идентификация» в переводе с латинского «identifico» обозначает отождествление. То есть, речь идет об установлении видовой и вариантной принадлежности микроорганизмов, выделяемых из окружающей среды. Это определение таксономической принадлежности осуществляется путем сопоставления основных, выявленных исследователем признаков у выделенных культур (классификационными признаками микробов, описанных в литературе или определителях). Схема такова: исследователь выделяет микроб в «чистой культуре» - изучает основные характеристики культуры - сопоставляет выявленные признаки с известными таксономическими группами.
Следовательно, идентификация микроба - это заключительный этап любого микробиологического исследования с целью обнаружения микроорганизмов в объектах внешней среды или лабораторной диагностики инфекционной болезни.
Первым шагом идентификации является получение микробов в чистой культуре. В зависимости от изучаемого микроорганизма методы получения чистых культур варьирует от повторных рассевов в чашках Петри на средах общего назначения до выделения изолированных колоний.
Далее описывают культуральные, исследуют морфологические и физиолого-биохимические признаки чистой культуры бактерий. По совокупности всех признаков определяют таксономическую принадлежность бактерии.
Пример. Культуральные признаки: на рыбопептонном агаре бактерия образует серо-белую колонию правильной округлой формы. Колония выпуклая, имеет гладкую поверхность, ровный край и выделяет желто-зеленый пигмент, окрашивающий питательную среду.
Морфологические признаки: бактерия имеет форму палочки, по Граму окрашивается отрицательно, спор не образует, подвижна, имеет полярные жгутики. Капсулу не образует.
Физиолого-биохимические признаки: бактерия - аэроб, усваивает органические соединения (гетеротроф), каталазо- и оксидазоположительная, крахмал не гидролизует, но разлагает глюкозу с образованием кислоты без газа в аэробных условиях.
Обратившись к части методических указаний, в которой перечислены таксономические группировки бактерий, находим раздел «Грамотрицательные бактерии», в этом разделе выбираем бесспоровые палочки, аэробы, гетеротрофы. В соответствии с другими физиолого-биохимическими признаками определяем, что выделенная бактерия относится к семейству Pseudomonadaceae, род Pseudomonas.
3. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ
ХАРАКТЕРИСТИК МИКРОБОВ
3.1. Получение чистой культуры и описание
культуральных признаков.
3.1.1. Выделение чистой культуры.
Основным методом выделения чистых культур бактерий является метод, предложенный Р. Кохом, принцип которого заключается в получении культуры бактерий из изолированных колоний. При выделении чистой культуры аэробов накопительную культуру или исследуемый материал высевают на плотную питательную среду. Порядок работы следующий. Расплавленную питательную среду разливают в стерильные чашки Петри. После того как среда застынет, на её поверхность наносят каплю исследуемого материала и стерильным шпателем Дригальского распределяют каплю сначала по одной стороне поверхности питательной среды в чашке Петри, затем по второй. Этим же шпателем протирают поверхность плотной среды во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Чашки инкубируют при оптимальной для микробов температуре (чаще всего - 37С) до 2-х суток. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микробов, тогда как в последующих - изолированные колонии.
Рассеивать накопительную культуру можно методом истончающегося штриха. В этом случае накопительную культуру или её разведение отбирают петлей и проводят штрихи по плотной питательной среде в чашке Петри в определенном порядке. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют. Чашки термостатируют 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизма. Выросшие изолированные колонии методом штриха отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной среды или в жидкую среду.
Изолированные колонии анаэробов и факультативных анаэробов получают методом глубинного посева. С этой целью в пробирки с расплавленной питательной средой, охлажденной до 40-37С, высевают по 0,5-1,0 мл разведения исследуемого материала с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Среду быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение агаризованной среды с посевом. Конец капилляра запаивают. При удачно выбранном разведении в пробирке или пипетке вырастают изолированные колонии. Для их извлечения пробирку (или пипетку) слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки или быстро опустив в теплую воду, при этом агар, прилегающий к стенке, плавится и содержимое столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным скальпелем и извлекают колонии, захватывая их стерильной капиллярной пипеткой или петлей. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции его разламывают стерильным пинцетом и участки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.