- •Введение
- •Микроорганизмов
- •1. Принципы систематизации и классификации микробов.
- •2. Идентификация микроорганизмов
- •3.1.2. Определение чистоты выделенной культуры.
- •3.1.3. Культуральные признаки.
- •А. Рост на плотных питательных средах.
- •Б. Рост на жидких питательных средах.
- •Б. Окраска препарата по Граму.
- •3.2.2. Методы исследования живых клеток. А. Препарат «раздавленная капля»
- •Б. Препарат «висячая капля».
- •В. Препарат «отпечаток»
- •3.2.3. Цитохимические методы исследования строения микробов а. Окраска капсул и приготовление красителей а) Окраска капсул
- •Б) Приготовление красителей для окраски капсул.
- •Б. Определение кислотоустойчивости бактерий.
- •В. Окраска спор и приготовление реактивов. А) Окраска спор
- •Б) Реактивы для окрашивания спор бактерий
- •Г. Окраска жгутиков а) Приготовление препарата
- •Б) Методы окрашивания.
- •В) Реактивы для окраски жгутиков.
- •Д. Окраска включений клеток микроорганизмов
- •Препараты для окрашивания включений.
- •Е. Выявление нуклеоида и приготовление реактивов а) Методы выявления
- •Б) Реактивы для выявления нуклеоида.
- •3.3. Определение физиолого-биохимических характеристик.
- •3.3.1. Отношение к кислороду
- •3.3.2. Отношение к температуре
- •3.3.3. Тест на окисление-брожение, или тест Хью-Лейфсона
- •3.3.4. Отношение к углеводам и пятиатомным спиртам
- •Д. Ввыявление индола и применяемые реактивы. А) Методы выявления
- •Б) Применяемые реактивы.
- •Е. Определение ферментов бактерий. А) Определение липазы
- •Б) Определение каталазы.
- •Ж. Выявление способности бактерий восстанавливать нитраты в нитриты.
- •З. Определение интенсивности кислотообразования.
- •И. Выявление аммиака.
- •1. Грамотрицательные формы
- •1.1. Грамотрицательные бактерии, не образующие спор
- •1.1.1. Скользящие бактерии
- •1.1.2. Почкующиеся и (или) стебельковые бактерии
- •1.1.3. Извитые бактерии
- •1.1.4. Спиральные и изогнутые бактерии
- •1.2. Грамотрицательные аэробные палочки
- •1.3. Крупные овальные или палочковидные клетки, свободноживущие аэробные азотфиксаторы
- •1.4. Бактерии, использующие метан и метиловый спирт
- •1.5. Солелюбивые палочки и кокки
- •1.6. Роды с неясным систематическим положением (аэробные овальные кокки и палочки)
- •1.7. Факультативно-анаэробные палочки
- •1.8. Роды с неясным систематическим положением
- •1.9. Грамотрицательные кокки и коккобациллы
- •1.10. Грамотрицательные анаэробные кокки
- •1.11. Грамотрицательные аэробные хемолитотрофные бактерии
- •1.12. Грамотрицательные облигатно-анаэробные палочки, образующие метан
- •1.13. Риккетсии
- •1.14. Микоплазмы
- •2. Грамположительные формы
- •2.1. Грамположительные аспорогенные палочковидные бактерии
- •2.2. Палочки и (или) коккобактерии аэробы или микроаэрофилы неясного систематического положения
- •2.3. Палочки и кокки, образующие эндоспоры
- •2.4. Грамположительные кокки
- •2.5. Актиномицеты и родственные им организмы
- •2.5.1. Секция 1. Паразиты и патогены человека и животных.
- •2.5.2. Секция II. Фитопатогенные бактерии
- •2.5.3. Секция III. Непатогенные каринобактерии
- •2.6. Бактерии с многогнездовыми спорангиями
- •2.7. Актинопланы
- •2.8. Стрептомицеты
- •Список литературы
- •Оглавление
Б) Применяемые реактивы.
Реактив Несслера: 20 г KJ растворяют в 50 мл дистиллированной воды и добавляют до насыщения (около 32 г) небольшими порциями AgJ2; затем приливают 460 мл воды и вносят 134 г КОН. Отстоявшуюся жидкость сливают в темную склянку.
Приготовление парадиметиламидобензальдегида. 4 г парадиметиламидобензальдегида растворяют в 30 мл 96%-го этилового спирта и добавляют 80 мл концентрированной соляной кислоты.
Е. Определение ферментов бактерий. А) Определение липазы
Посев исследуемой культуры выполняют глубинным методом в желточно-солевой агар или штрихом по его поверхности. Термостатируют при 37С несколько суток. Вокруг жирорасщепляющих колоний появляется непрозрачная зона солей жирных кислот.
Поскольку жиры не смешиваются с водой, для приготовления сред используют твины - эфиры жирных кислот и сорбита. Твины 40, 60 и 80 содержат соответственно пальмитиновую, стеариновую и олеиновую кислоты. Состав среды в г/л: твин - 10 г, пептон - 10 г, NaCl - 5 г, CaCl2*Н2О - 0,1 г, агар - 20 г, pH 7,4. Водный раствор твина стерилизуют отдельно при 0,5 атм., а остальную среду - при 1,0 атм. Среду разливают в чашки Петри и после ее застывания материал высевают на поверхность штрихом или уколом. Посевы выдерживают в термостате при оптимальном для данного микроба режиме. На наличие липазы указывает образование вокруг колонии или штриха непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из твина.
Б) Определение каталазы.
На поверхность колонии микроба, выращенного на плотной питательной среде, наносят каплю 1-3%-го раствора перекиси водорода и прикрывают стерильным покровным стеклом. При наличии каталазы появляются пузырьки газа (атомарный кислород), которые хорошо видны под стеклом.
Ж. Выявление способности бактерий восстанавливать нитраты в нитриты.
К 10 мл исследуемого материала добавляют 1 мл раствора Грисса и доводят до кипения. В присутствии нитритов появляется красное окрашивание (т.к. реактив очень к ним чувствителен).
Реакция с цинк-иод-крахмалом. В лунку фарфоровой пластинки вносят 3 капли реактива, каплю 20%-й серной кислоты и каплю исследуемого материала. В присутствии нитритов появляется темно-синее окрашивание.
Приготовление реактива Грисса (состоит из двух растворов). Первый - 0,5 г сульфаниловой кислоты в 150 мл разбавленной уксусной кислоты, второй - 0,1 г -нафтиламина в 20 мл воды с добавлением 150 мл разбавленной уксусной кислоты.
Цинк-иод-крахмаловая смесь: 4 г крахмала размешивают в небольшом количестве воды, доводят до кипения и при постоянном помешивании добавляют к кипящему раствору хлорида цинка (20 г ZnCl в 100 мл воды). Смесь кипятят до растворения крахмала, добавляют 2 г сухого йодистого цинка и доливают водой до литра. Раствор хранят в темной посуде в темном месте.
З. Определение интенсивности кислотообразования.
Реакция с метиленовым красным: к жидкой культуре бактерий в среде с углеводом добавляют индикатор метиленовый красный. При интенсивном кислотообразовании окраска культуры меняется на малиновый.
Реакция Фогес-Проскауера (реакция образования ацетилметилкарбинола): к жидкой культуре бактерий добавляют 40% -й раствор КОН. В присутствии ацетилметилкарбинола через несколько минут появляется розовое окрашивание.
Оксидазный тест: материал из исследуемой колонии наносится на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для определения оксидазной активности (30-40 мг -нафтола непосредственно перед применением растворяют в 2,5 мл спирта-ректификата, добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и растворяют 40-60 мг диметилфенилендиамида). Если через 2-4 минуты материал на фильтре посинел - бактерии считаются оксидазоположительными, если окраска материала не изменилась или он порозовел - бактерии оксидазоотрицательные. Реактив можно нанести непосредственно и на колонию. В этом случае оксидазоположительные колонии оксидазоположительных бактерий синеют или вокруг них появляется синий ободок. Колонии оксидазоотрицательных бактерий не изменяются или розовеют.