1.3.7. «Сигнальный» анализ хлорированной воды

1 л хлорированной воды фильтруют через мембранный фильтр № 3. В пустой стерильной чашке Петри фильтр складывают вчетверо и, соблюдая правила асептики, переносят в стерильную микропробирку. В пробирку вливают 1 мл ГПС для ускоренного выращивания, поверх среды помещают стерильный ватный тампон так, чтобы он покрывал всю поверхность среды. Пробирку закрывают ватной пробкой и термостатируют 7 часов при температуре 37º С. параллельно термостатируют контрольную пробирку с водой, заведомо загрязненной кишечной палочкой. При наличии в хлорированной воде кишечных палочек в пробирке образуются газы, которые собираются под тампоном. В контрольной пробирке газообразование констатируется постоянно.

Уточнение результатов анализа. Получив «сигнальный» ответ, из всех пробирок штрихом производят посев на прогретую питательную среду Эндо в чашки Петри. Посевы проращивают 7 часов при 40-41º С. из подозрительных колоний делают мазки и окрашивают по Граму, при наличии в мазках грамотрицательных бесспоровых палочек, оставшуюся часть колонии засевают в маленькие пробирки с ГПС и индикатором Андреде. В пробирки вносят стерильные ватные тампоны и закрывают ватными пробками. Если через 2 часа выращивания при 43º С в пробирках появляется газ и изменяется окраска, то это свидетельствует о присутствии в воде кишечной палочки.

1.4. Принципы обнаружения в воде патогенных микроорганизмов.

Обнаружить патогенные микробы в воде бывает очень трудно по ряду причин. Во-первых, попав в воду в сравнительно концентрированном виде, они постепенно рассеиваются, частично оседают на дно и погибают под действием неблагоприятных физико-химических факторов, в результате их концентрация резко уменьшается.

Во-вторых, сапрофитная микрофлора водоисточника оказывает подавляющее действие на патогенов не только в самом водоисточнике, но и при росте на питательных средах.

Поэтому при выделении патогенной микрофлоры из воды применяют следующие приемы:

1. Прямой посев на элективные питательные среды.

2. Предварительную концентрацию микробов в небольшом объеме воды и последующий посев на питательные среды.

Концентрацию микробов можно осуществить физическими способами (фильтрацией, центрифугированием, выпариванием), осаждением коагулянтами, осаждением агглютинирующими сыворотками, используя положительный хемотаксис, обнаружение методом «реакция нарастания титра бактериофага», заражение исследуемой водой чувствительных животных. В некоторых случаях приходится использовать комбинированные методы обогащения.

1.4.1. Ускоренные методы исследования воды

Для индикации патогенных микроорганизмов в воде предложены ускоренные методы, которые являются и более чувствительными и более быстрыми. Наибольшее применение получил метод люминесцентно-серологический, который рекомендуют для обнаружения в воде эшерихий, сальмонелл, шигелл, вибрионов и др. Метод иммунофлуоресценции основан на способности антител, предварительно обработанных различными флорохромами (флуоресцеина изотиоцианат, родамина сульфохлорид, родамина сульфофторид) и др., адсорбироваться на поверхности микробной клетки и вызывать ее свечение. Метод флуоресцирующих антител применяется в трех модификациях – прямой, непрямой и непрямой метод с добавлением комплемента. При прямом методе каплю исследуемой воды, в которой предполагается наличие патогенных бактерий, помещают на предметное стекло, обрабатывают специфичной к искомому микробу люминесцирующей сывороткой и наблюдают под люминесцентным микроскопом. При положительном результате на темном фоне препарата видна яркая люминесценция по периферии клеток. При непрямом методе обработка препаратов происходит в два этапа: специфической иммунной сывороткой выявляют присутствие соответствующих бактерий, на следующем этапе обнаруживают образовавшийся комплекс обработкой меченой иммунной сывороткой, содержащей антитела к глобулинам специфической сыворотки. Этот метод имеет существенное преимущество перед прямым, т.к. для выявления любых бактерий используется одна меченая сыворотка против антител – глобулинов, содержащихся в специфической сыворотке (как правило, глобулинов кролика). При непрямом методе с добавлением комплемента препарат обрабатывают в три этапа: сначала специфической к искомому микробу иммунной сывороткой, затем – комплементом, который адсорбируется на комплексе антиген-антитело, и, наконец, иммунной противокомплементарной флуоресцентной сывороткой. Следует помнить, что после обработки препарата каждым ингредиентом перед нанесением следующего необходимо тщательное промывание – удаление не вступивших в реакцию веществ. Для повышения эффективности метода следует концентрировать бактерии в исследуемой воде на мембранных фильтрах, центрифугированием или посевом в среды обогащения. В этом случае люминесцентно-серологическим методом удается обнаружить энтеробактерии при наличии в пробах воды даже одиночных клеток в 1 мл. Метод флуоресцирующих антител рекомендуется применять при индикации в воде возбудителей туляремии, чумы, бацилл сибирской язвы.

Для ускоренного обнаружения в воде БГКП предложен радиоизотопный метод. Принцип метода заключается в определении количества БГКП по количеству выделяемой ими СО₂ из элективных сред, меченых ¹⁴С. Результат можно получить через 5-6 часов.