Определение титра кишечной палочки в воде.

1.3.1. Метод мембранных ультрафильтров.

Этот метод был предложен в 1923 году А.С. Разумовым, Е.В. Диановой, А.А. Ворошиловой для учета общей численности бактерий в воде, а метод учета E. coli был разработан К.К. Барсовым на Рублевской водопроводной станции. Мембранные ультрафильтры представляют собой нитрацеллюлозные пленки с различным диаметром пор. Мембранные фильтры выпускают шести номеров.

Таблица 6.

Характеристика мембранных ультрафильтров

№ фильтра	Средняя скорость фильтрования 500 мл воды, мин.	Средний диаметр пор, мкм
1	9,0	0,35
2	4,5	0,50
3	2,5	0,70
4	1,16	0,90
5	0,60	1,20
6	мгновенно	более 1,20

Для определения кишечной палочки наиболее пригодны фильтры № 2 или № 3. При наличии большого количества взвешенных частиц в воде её пропускают через предварительный фильтр № 6.

Подготовка мембранных ультрафильтров к анализу.

Мембранные фильтры, вынутые из фабричной упаковки, проверяют на наличие дефектов (надломы, трещины и др.) и по одному опускают в стакан с дистиллированной водой, подогретой до 50-60º С, постепенно подогревают до кипения и кипятят на спокойном огне 15-20 мин. Бурное кипячение приводит к скручиванию фильтров. Такие фильтры к работе непригодны. Кипячение повторяют 2-3 раза для удаления растворителей, применявшихся при изготовлении фильтров. Подготовленные фильтры после кипячения прикрывают стерильной крышкой, такие фильтры можно использовать на второй и третий день после непродолжительного кипячения.

Фильтрация воды и выращивание колоний.

Фильтрацию воды осуществляют в аппарате Зейтца. Рабочую часть фильтра стерилизуют кипячением или фламбированием. При проведении фильтрации на сетку фильтра Зейтца накладывают кружок простерилизованной фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, а затем мембранный ультрафильтр, собирают прибор и фильтруют столько воды, чтобы на фильтре выросло не более 50-ти колоний. Водопроводную воду фильтруют в объеме 300-500 мл, загрязненную воду фильтруют после предварительного разведения стерильной водой. После окончания фильтрации мембранный фильтр профламбированным пинцетом переносят на поверхность среды Эндо, так, чтобы между фильтром и питательной средой не было пузырьков воздуха. В одну чашку можно положить несколько фильтров. Чашки помещают крышками вниз в термостат при температуре 37º С на 18-24 часа (при посеве воды из колодцев и открытых водоемов сапрофиты могут подавить рост кишечной палочки, поэтому рекомендуется проращивать фильтры при температуре 41-43º С).

При среде Эндо учитывают пять групп колоний: тёмно-красные с металлическим золотистым блеском, тёмно-красные, розовые и красные, бесцветные с розовым или красным центром, бесцветные прозрачные колонии.

Из 2-х-3-х типично окрашенных колоний с каждого фильтра делают мазки и окрашивают по Граму. Отсутствие в мазках грамотрицательных бесспоровых палочек дает основание для отрицательного ответа; при наличии в мазках грамотрицательных палочек, не образующих спор, с материалом из подозрительных колоний проводят оксидазный тест: для этого мембранный ультрафильтр с выросшими на нем колониями переносят, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченный реактивом для определения оксидазной активности бактерий (30-40 мг α-нафтола растворяют в 2,5 мл спирта-ректификата и добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и растворяют 40-60 мг диметилпарафенилдиамина). Раствор готовят непосредственно перед употреблением. Через 2-4 минуты определяют результат: все посиневшие колонии, или колонии с синим ободком, не учитывают – эти бактерии обладают положительной оксидазной активностью, и не относятся к группе кишечных палочек. Заключительный этап идентификации – материал из колоний с отрицательной оксидазной активностью (колонии, не изменившие цвет после проведения оксидазного теста) высевают уколом в столбики питательных сред Гисса с лактозой и сахарозой и индикатором. Посевы термостатируют при температуре 37º С 4-5 часов. Кишечная палочка сбраживает лактозу с образованием кислоты и газа. Наличие кислоты определяют по изменению окраски индикатора, газ наблюдают в виде пузырьков в столбике среды, сахарозу кишечная палочка не сбраживает. Если в пробирке с лактозой обнаружена только кислота, то термостатирование продолжают до 24-х часов, если и в этом случае газ не проявляется, результат считают отрицательным.

Пример расчета титра Сoli. При фильтрации 500 мл воды на фильтре выросло 2 колонии, характерных для кишечной палочки. В этом случае титр Сoli составит 250 мл:

500/2=250 мл.

Индекс Сoli = 1000/250=4.