5.2. Определение концентрации антибиотика в продуктах

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов, но наиболее распространен метод диффузии антибиотика в питательный агар. В этом случае используют метод канавки или выпускаемые промышленностью диски, пропитанные антибиотиком, количество которого в диске стандартизовано.

5.2.1. Определение концентрации антибиотика методом бумажных дисков.

В чашке Петри готовят пластинку РПА или МПА. На поверхность чашки засевают культуру бактерии так, чтобы получился сплошной рост (газон). На поверхность среды стерильным пинцетом укладывают диски с антибиотиками разной концентрации. В определенном месте чашки стерильным пробочным сверлом вынимают блок питательной среды и в образовавшийся колодец вносят раствор антибиотика неизвестной концентрации. Чашки помещают в термостат на 18-24 часа при температуре 37⁰С. Результаты опыта учитывают измерением зоны задержки роста вокруг дисков (в мм, включая диаметр диска). По полученным данным строят график –зависимость величины зоны задержки роста от концентрации антибиотика. По этому графику определяют неизвестную концентрацию антибиотика, отложив на оси диаметр задержки роста вокруг колодца с антибиотиком неизвестной концентрации.

5.2.2. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом канавки

Для выполнения анализа заготавливают чашку Петри с пластинкой РПА. Перед работой пластинку подсушивают. Затем перпендикулярно диаметру пластинки биологической петелькой профламбированной и охлажденной делают несколько посевов штрихом разных культур бактерий, полученных при исследовании микрофлоры рыбы или морепродуктов. Далее перпендикулярно штрихам по диаметру чашки стерильным скальпелем в пластинке РПА вырезают канавку, агар выбирают, а канавку заполняют раствором антибиотика, чувствительность бактерий к которому определяют. Посев помещают в термостат, не переворачивая чашку. Посев термостатируют 24 часа при температуре оптимальной для исследуемых бактерий.

Учет результатов: В процессе термостатирования антибиотик из раствора диффундирует в пластинку РПА. Бактерии устойчивые к данному антибиотику дают рост непосредственно около канавки и далее по штриху. Бактерии чувствительные к этому антибиотику на пластинке не растут вообще, или растут на некотором расстоянии от канавки, там, где концентрация антибиотика уменьшается.

5.2.3. Определение хлортетрациклина в продуктах

Определение хлортетрациклина в продуктах осуществляется методом диффузии в агар (метод агаровых колодцев).

Определение концентрации тетрациклина проводится по методике разработанной Институтом питания АМН СССР и ВНИИМП и состоящей в следующем.

От средней пробы измельченного образца морепродукта отбирают 40 г и помещают в стакан со 120 мл цитратсолянокислого буфера (рН 4,6-4,8). Смесь мяса с буфером измельчают при помощи микроизмельчителя в течение 1-2 мин и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат используют для определения концентрации антибиотика. Для этого в стандартные чашки Петри наливают по 30 мл стерильного РПА (рН 7,2-7,4) и после подсушивания в термостате при 37⁰С в течение 20-30 минут на поверхность застывшего агара наносят 0,1 мл взвеси односуточной культуры Bac. subtilis L. или Bac. cereus F. (концентрация клеток 500кл/мл). Шпателем Дригальского культуру равномерно распределяют по поверхности агара. После распределения культуры стерильным пробочным сверлом диаметром 7,5 мм вырезают «колодцы» до 6-8 на чашку. В каждый колодец стерильной пипеткой капельницей вносят по 0.1 мл фильтрата. Чашки термостатируют 16-18 часов при температуре 28⁰С. После термостатирования замеряют диаметр стерильных зон вокруг колодцев, включая и диаметр колодца. И по их величине с помощью стандартной кривой определяют концентрацию тетрациклина.