Порядок выполнения работы. Определение микробного числа воды.

Микробное число воды – это количество колоний микроорганизмов, вырастающих при посеве 1 мл воды на РПА за 24 часа при температуре 37 С. Этим показателем определяются не все микроорганизмы, а только те, которые способны расти на РПА при указанной температуре, т.е. это сапрофитные, мезофильные, аэробные и часть факультативно-анаэробных микробов. Микробное число воды характеризует общую загрязненность её микроорганизмами и для водопроводной воды не должно превышать 50.

При определении микробного числа водопроводной воды, воды из родников, артезианских скважин пробу сеют без разведения, а воду из открытых водоемов разбавляют стерильной водой. Степень разведения выбирают, исходя из предполагаемой загрязненности воды. Из каждой пробы употребляют для посева не менее двух различных разведений, с тем, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Воду вносят стерильной пипеткой в стерильную чашку Петри, соблюдая правила стерильности, затем в чашку вливают 15 мл расплавленного и охлажденного до 45С РПА или МПА, вращательным движением перемешивают воду с питательной средой. После застывания среды чашки вверх дном помещают в термостат. На крышке записывают все данные об анализе. Посевы водопроводной воды выращивают 24 часа при температуре 37С, а посевы воды из естественных водоемов ещё 48 часов при температуре 20С. Подсчитывают колонии как в глубине, так и на поверхности среды. Чашки не учитываются, если при посеве 1 мл воды из разведения 1:100 и более выросло меньше 20 колоний, а также не учитываются чашки при наличии в них роста ползущих колоний, маскирующих более ½ чашки.

Просчитывают среднее арифметическое по параллельным пробам. При малом числе колоний просчитывают колонии на всей поверхности чашки, при обильном росте колоний допустимо просчитать колонии в 10 квадратах по 1 см², определить среднюю по 10 просчетам и пересчитать на площадь чашки Петри по формуле:

М=r² * n , где:

М – микробное число воды, кл/мл;

n – среднее число колоний на 1 см² площади чашки Петри;

r – радиус чашки Петри = 4,5 см;

 - 3,14.

Результат просчета округляют следующим образом:

Таблица 4.

Результаты просчета

Количество колоний в чашке	Результат
От 1 до 100	Фактическое число подсчитанных колоний
От 101 до 1000	Округлить до десятка
От 1001 до 10000	Округлить до сотни
От 10001 до 100000	Округлить до тысячи
От 100001 до 1000000	Округлить до десятков тысяч

1.3. Определение кишечной палочки в воде. Характеристика кишечной палочки.

E. coli является нормальным обитателем – комменсалом микрофлоры кишечника человека и животных. У рыб, диких птиц и насекомых E. Coli является случайным паразитом и попадает к ним при контакте с фекалиями человека и домашних животных. Так, у домашних уток, гусей она обнаруживается постоянно, а у диких - только в редких случаях. У животных Арктики кишечная палочка обнаруживается только в 10% случаев, такие же результаты получены при исследовании почвы и водоемов. В девственных почвах Арктики, на высокогорьях никаких разновидностей E. coli не встречается. При непостоянном загрязнении почвы в ней обнаруживаются E. coli citrovorum и E. coli aerogenes – результат длительного пребывания E. coli в сапрофитных условиях.

Считается, что сначала E. coli стала непатогенным паразитом кишечника человека, с приручением животных она перешла к ним. При интенсивном обмене кишечной флорой между животными организмами, отдельные разновидности кишечной палочки со свойствами патогенности в больших сообществах получили преимущество (вызывали диарею). Это было полезно для распространения бактерии, поэтому это свойство закрепилось, и при дальнейшей эволюции бактерии появились и более патогенные штаммы.

Кишечная палочка – сборная совокупность бактерий, имеющих общие признаки, которые могут сильно изменяться в зависимости от того биоценоза, в котором микроб развивается. Особенно резко свойства кишечной палочки меняются, когда в организм хозяина внедряются патогенные микробы. В этом случае E. coli может утратить способность сбраживать лактозу (образуются лактозонегативные варианты – штаммы E. coli). Такие бактерии в массовых количествах выделяются от больных брюшным тифом, паратифом, дизентерией в конце болезни и в начале периода выздоровления.

E. coli была открыта в 1885 году Эшерихом. Она представляет собой небольшую грамотрицательную палочку, длина палочки 2,5-3,0 мкм, поперечник 0,5-0,8 мкм, может давать кокковидные формы и нити, спор не образует, некоторые штаммы образуют капсулу, большинство подвижны, имеют 2-6 жгутиков, но встречаются и неподвижные формы.

Кишечная палочка хорошо растет на МПА, РПА, РБ, МБ. На плотных средах она дает круглые мелкозернистые колонии 2-3 мм в диаметре, молочно-голубоватые, колонии могут быть гладкими и шероховатыми. При росте на бульоне сначала появляется диффузное помутнение, через несколько дней образуется осадок, а на поверхности – нежная пленка.

E. coli сбраживает глюкозу, лактозу, мальтозу, маннит с образованием кислоты и газа по типу гетероферментативного молочнокислого брожения, сахарозу не сбраживает. Желатин не разжижает, разлагает триптофан с образованием индола (но встречаются формы, не образующие индол), створаживает молоко через 1-4 суток, сероводород не образует.

Международный стандарт дифференцирует бактерии группы кишечной палочки E. coli и бактерии фекально-кишечной палочки.

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП) сбраживают лактозу при температуре 35-37 С, а бактерии группы фекальной кишечной палочки (БГФКП) сбраживают её при 44С.

Идентификация кишечных палочек осуществляется на основании группы признаков ТИМАЦ (ТЛИМАЦ): Т – температурный тест (тест Эйкмана). Для E. coli этот тест положительный, т.к. она сбраживает углеводы при температуре 43-44 С до кислоты и газа. Большинство бактерий других групп этим признаком не обладают. Однако, имеются сведения о том, что повышенная температура не является оптимальной для E. coli, и рост E. coli, выделенной из фекалий при температуре 37 С интенсивнее, чем при 43 С.

И – образование индола. E. coli образует индол при расщеплении триптофана, тиразина, фенилаланина. Определение индола:

1. по методу Мореля – в пробирку с культурой исследуемой бактерии подвешивают индикаторную бумажку, смоченную 12% раствором щавелевой кислоты. На следующий день в присутствии индола бумажка розовеет. Этот метод достаточно простой и удобный.

2. Метод Легаль-Вейля более чувствителен. К суточной или двухсуточной бульонной культуре добавляют 5 капель 5% раствора нитропруссида натрия, 5 капель 40% раствора NaOH и 7 капель концентрированной СН₃СООН. В присутствии индола появляется сине-зеленое или темно-синее окрашивание.

М – реакция с метиловым красным служит для определения интенсивности кислотообразования. К жидкой культуре бактерий добавляют индикатор метиловый красный. При интенсивном кислотообразовании, что характерно для E. coli, окраска культуры меняется на малиновый цвет.

А – реакция образования ацетилметилкарбинола (ацетоин СН₃СНОНСООСН₃) – реакция Фогес-Проскауэра. К жидкой культуре бактерий добавляют 40% раствор КОН, в присутствии ацетилметилкарбинола появляется розовое окрашивание. E. coli не образует ацетилметилкарбинол.

Ц – цитратный тест. Характеризует способность бактерий усваивать лимонную кислоту или ее соли в жидкой питательной среде Козера или плотной питательной среде Симмонса. Фекальные кишечные палочки не растут на этих средах. Эти бактерии цитратотрицательные. Если бактерия способна усваивать цитраты – цитратположительная, это говорит о том, что кишечная палочка довольно длительное время выживала в природной среде и уже не является показателем свежего фекального загрязнения.

Л – сбраживание лактозы. Санитарно-показательные формы сем. Enterobacteriaceae сбраживают лактозу с образованием кислоты и газа (лактозоположительные формы). Патогенные бактерии из этого семейства – сальмонеллы и шигеллы лактозу не сбраживают.

Дополнительный тест – способность бактерий расщеплять мочевину. E. coli мочевину не расщепляет.

Большинство кишечных палочек подвижны. Подвижность бактерий определяют в столбике питательной полужидкой среды Гисса или среде Пешкова. Посев выполняют уколом. Неподвижные бактерии растут в виде тяжа, подвижные вызывают общее помутнение среды.

Таблица 5.

Классификация бактерий группы кишечной палочки по Минкевичу, основанная на эволюционном развитии сем. Enterobacteriaceae

Вид бактерии	Рост на цитратах	Реакция с метилрот	Реакция Фогес-Проскауэра	Образование индола	Бродильная при 44º С	Подвижность	Образование H2S	Расщепление мочевины
E. coli commune	-	+	-	+ / -	+	+ / -	-	-
E. coli citrovorum	+	- редко +	-	- редко +	- редко +	+ / -	+ / -	-
E. coli aerogеnes	+	-	+	-	-	+	-	+ / -

Желатин бактерии не разжижают, за исключением E. coli aerogenes, у которой этот признак вариабелен.

Попадая во внешнюю среду, E. coli commune приспосабливается и через полгода превращается в E. coli citrovorum, начинает расти на средах с цитратами, сбраживать сахарозу и прекращает сбраживать сахара при температуре 43º С, далее она превращается в E. coli aerogenes, которая к вышеперечисленным признакам приобретает способность вырабатывать ацетилметилкарбинол.

На питательной среде Левина E. coli образует фиолетовые колонии, на бактоагаре – красные, Киченко – желтые, на среде Ресселя с индикатором Андреде – красные.