4.5.1.2.3. Энтерококки.

Для учета энтерококков в пищевых продуктах применяют предварительный и подтверждающий тесты. Предварительный тест включает определение НВЧ энтерококков путем посева в бульон с азидом и декстрозой. При наличии положительных результатов (помутнение) материал пересевают в бульон с этиленвиолетом и декстрозой, посев инкубируют 48 часов при 35⁰С. Для выделения всех видов энтерококков в пищевых продуктах рекомендуется использовать питательную среду Пейкера (кристаллвиолет, азид, кровяной агар). Посев производят из 10% взвеси продукта. 0,1 мл взвеси высевают на поверхность застывшей питательной среды в чашку Петри, тщательно втирают стерильным шпателем Дригальского и проращивают 48 час при температуре 37⁰С. Колонии энтерококков образуют на среде черные колонии.

4.5.1.2.4. Патогенный стафилококк.

Первичная среда для выделения стафилококка должна четко дифференцировать его от сопутствующей микрофлоры Наилучшие результаты для исследования продуктов на наличие стафилококка дали питательные среды, содержащие яичный желток, теллурит калия и полимиксин В и инкубация посевов при температуре 45⁰С.

При исследовании поврежденных и неповрежденных после термической обработки St. aureus рекомендуется использовать триптиказосоевый агар, а для неповрежденных клеток добавлять 7 % NaCl.

Канадские стандарты рекомендуют посев 0,5мл 10% взвеси на поверхность двух чашек с теллуритглицериновым агаром (1% водный раствор теллурита калия, желтковая суспензия на сердечно-мозговом бульоне). Материал втирают в среду шпателем Дригальского, чашки инкубируют не переворачивая 24 часа при температуре 37⁰С. Патогенные (коагулазоположительные) стафилококки образуют черные колонии, окруженные светлым ореолом.

По другой методике исследуемый материал рекомендуется сначала подращивать на среде обогащения (6,5 и 10% соляной бульон и 1% глюкозный бульон). Посевы инкубируют 18-24 часа при температуре 37⁰С. При исследовании продуктов содержащих большое количество соли, подращивание не производят.

Одновременно с посевом на среду обогащения делают посевы поверхностным методом на чашки с молочно-соляным, желточно-соляным и Брайд-Паркер агаром. Посевы инкубируют при температуре 37⁰С 24-48 часов. На молочно-соляном и желточно-соляном агарах стафилококки образуют выпуклые колонии правильной круглой формы, фарфорово-белые, лимонно-желтые или золотисто-желтые. На Брайд-Паркер агаре образуются черные колонии. Вокруг колоний патогенных стафилококков на желточно-солевом и Брайд-Паркер агаре образуются зоны летициназной активности. В случае отсутствия роста стафилококков при прямом посеве на элективные среды производят посев со сред обогащения. Из подозрительных на стафилококки колоний делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют с иммерсией. При наличии в мазке Грамположительных стафилококков, культуру отсевают на скошенный РПА и с суточной культурой проводят реакцию плазмокоагуляции – вносят петлю суточной культуры стафилококка в стерильную плазму крови кролика, термостатируют до 12 часов при температуре 37⁰С. Патогенный стафилококк коагулирует плазму не более, чем за 12 часов.

4.5.1.2.5. Cl. botulinum.

Для выделения этой бактерии часто применяют кровяной агар и агар с яичным желтком, последний является хорошей питательной средой для выращивания клостридий. Проращивание посевов проводят в анаэробных условиях.

На желточных средах Cl. botulinum и некоторые другие клостридии образуют активные липолитические ферменты. Это выражается в образовании осадка под колонией и радужной пленки на поверхности колонии. Cl. botulinum не всегда дает типичную реакцию.

Известно, что слабая тепловая обработка или тепловой шок интенсифицируют прорастание многих спор, а нагрев при температуре 80⁰С в течение 30-60 мин. является обычным для суспензий Cl. botulinum. Если необходимо выявить споры Cl. botulinum типа Е или споры других непротеолитических штаммов этого организма то посевы прогревают при температуре 60⁰С в течение 15 мин.

Лучшей средой для обнаружения Cl. botulinum является мясная питательная среда Робертса, а температура инкубации 25-30⁰С. Мазохина-Поршнякова рекомендует для выделения этой бактерии посевной материал смешать с абсолютным спиртом в равных количествах, концентрация спирта в смеси должна составлять 50%, выдержать смесь 60 минут при комнатной температуре. Посев производят на плотные питательные среды для выделения Cl. botulinum, трубки Вейона или в высокие узкие трубки. Чашки Петри с посевами на любую из сред (сахарно-кровяной агар, среду Виллиса и Хоббси, агар Вильсон-Блера или печеночный агар с добавлением желтка) помещают в микроанаэростат, создают в нем вакуум и заполняют бескислородной газовой смесью, содержащей 10% СО₂. Посевы термостатируют 48 часов при температуре 30⁰ С. Из колоний похожих на Cl. botulinum (плоские колонии неправильной формы, пятнисто-сероватые) отбирают материал для проверки отсутствия каталазы и приготовления мазков. В мазках обнаруживаются характерные палочки со спорами. Клетка принимает вид теннисной ракетки.

4.5.1.2.6. Cl. perfringens.

Для лучшего выделения этой клостридии используют метод обогащения. Асептически отбирают 1 г или 1 мл исследуемого материала и вносят в две пробирки с 15 мл тиогликоллята. Посев прогревают 10 мин. на кипящей водяной бане. Посев термостатируют в анаэробных условиях в атмосфере СО₂ при комнатной температуре 72 часа. При наличии Cl. perfringens появляются черные колонии.

Для выделения чистой культуры Cl. perfringens используют сахарно-кровяной агар с кровью барана или человека. Накопительную культуру этой бактерии можно получить при посеве исследуемого материала или его разведений на среду Китта-Тароцци, жидкую казеиново-грибную среду, среду АКЖ (автолизат кильки с желатином), КПДГ (китово-печеночный-дрожжевой гидролизат). Из таких посевов с обильным газообразованием и мутью делают высев в чашки Петри на поверхность сред Вильсон-Блера или кровяного агара Цейслера. Посевы инкубируют в анаэростате при температуре 36⁰С. Также можно использовать желточный агар.

Другой метод выделения Cl. perfringens состоит в том, что по 1 мл гомогената или его разведений вносят в пробирки со средой Вильсон-Блера, кровяную среду Цейслера или желточную, тщательно перемешивают и выливают в стерильные чашки Петри, после застывания смеси чашки дополнительно заливают охлажденным до температуры 25⁰С МПА слоем не менее 2-х см. Посев инкубируют при температуре 45-46⁰С в течение 6-8 часов или 20 часов при температуре 37⁰С. Для определения таксономической принадлежности бактерий из характерных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. При наличии в мазке характерных толстых палочек с закругленными концами проводят пересев материала на среду Роберта и в лакмусовое молоко с цистеином. На среде Роберта (посев уколом) Cl. perfringens растет виде красной линии(восстановление нитратов в нитриты), на лакмусовом молоке при температуре 46⁰ С образуется губчатый красновато-сиреневый сгусток.

Упрощенный метод выявления Cl. perfringens в сырье включает посев на среду Вильсон-Блера, термостатирование посева в анаэробных условиях, далее посев на лакмусовое молоко с цистеином с последующей проверкой подвижности клеток и их способности образовывать нитриты из нитратов.

Из образцов сырья, прогретого при температуре 80⁰С в течение 10 мин, рекомендуется высевать не менее 3-х десяти кратных разведений, из образцов продуктов после мойки – не менее 2-х десятикратных разведений, из консервируемого продукта перед стерилизацией – одного разведения, из консервов – неразведенную пробу.

4.5.1.2.7. Vibrio parahaemolyticum.

Галофильный вибрион обычно находится на поверхности беспозвоночных, поэтому отбор проб проводится путем смыва при помощи тампона. Обычно делают 2-3 смыва в зависимости от размера образца. Поскольку галофильный вибрион на поверхности беспозвоночных встречается в небольших количествах, поэтому для его выделения требуется использование обогатительных сред с последующим пересевом на плотные среды.

Лучшей обогатительной средой является мясопептонный бульон, содержащий 5% NaCl. Обогатительную среду с посевом инкубируют 20 час. при температуре 37⁰С. Затем делают посев со среды на плотные среды TCBS или BTP Teepol. На этих питательных средах Vibrio parahaemolyticum растет в виде круглых гладких матовых колоний 3-5 мм в диаметре, центральные части колоний имеют синюю или зеленую окраску, в отличие от других морских вибрионов, Vibrio parahaemolyticum может расти при температуре 43⁰С и не ферментирует сахарозу.

Хорошей элективностью для галофильного вибриона обладает соляной бульон с колистином (ОКБ) с последующим посевом на САЖЦТ – соляной агар с желчью и цитратом тиосульфата.

Для исследования пищевых продуктов на наличие галофильного вибриона отбирают навеску 200 г, от которой отбирают 50 г, измельчают с добавлением стерильного 3% раствора NaCl или физиологического раствора (1:10) до получения однородной взвеси, ее отстаивают 10 минут и используют для исследований. Для разведения используют стерильный физиологический раствор. Посев производят на ДДА (дифференциально-диагностический агар) и инкубируют при температуре 37⁰С 24 часа. Выросшие колонии исследуют в прямо и косо проходящем свете. На темном сине-зеленом фоне среды наблюдаются полупрозрачные колонии правильной круглой формы, с гладкими краями, влажной гладкой поверхностью голубовато-зеленого цвета, от 1 до 5 мм в диаметре. Из подозрительных колоний делают мазки и окрашивают по Граму. В мазке при наличии Vibrio parahaemolyticum обнаруживаются Грамотрицательные прямые или слегка изогнутые палочки. Бактерии оксидазоположительны, подвижны. Бактерии не сбраживают лактозу и сахарозу, образуют индол из триптофана, реакция Фогес-Проскауера отрицательная, разлагают лизин и орнитин, но не разлагают аргинин, не растут в бульоне при содержании NaCl 10%.

4.5.1.2.8. P. Salmonella.

Для обнаружения сальмонелл проводится посев продукта на среды обогащения (селенитовый бульон, магниевая среда, среда Мюллера, среда Кауфмана) после встряхивания взвеси продукта в накопительной среде (30 мин) делают высев 0,2 мл поверхностным способом на плотные элективные среды Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитный агар (ВСА).Посевы на средах обогащения инкубируют 16-24 часа при температуре 37⁰С и делают повторные посевы на те же плотные питательные среды. Посевы проращивают сутки при температуре 37^ºС. На среде Эндо сальмонеллы образуют бледно-розовые колонии, на среде Плоскирева – прозрачные или слегка розоватые колонии, а на ВСА – черные с металлическим блеском, среда под колонией темнеет.

Из подозрительных колоний материал высевают штрихом и уколом в скошенный столбик комбинированной среды Ресселя или Олькеницкого. Посев термостатируют сутки при температуре 37⁰С. При росте сальмонелл столбик краснеет и чернеет, происходит его разрыв, скос не изменяется. Окончательный вывод о наличии сальмонеллы делают после проведения реакции агглютинации выделенной бактерии со специфичной для сальмонеллы сывороткой. При наличии сальмонеллы происходит склеивание бактерий с антителами сыворотки, образуются тяжелые хлопья агглютината, которые оседают, капля просветляется. В случае отсутствия сальмонеллы в капле образуется достаточно стойкая мелкодисперсная взвесь, капля остается мутной. Для проведения реакции агглютинации исследуемый материал биологической петлей смешивают на стерильном предметном стекле с каплей специфичной для сальмонеллы сыворотки.