4.5.1.2. Прямые методы.

Помимо чашечных методов применяется прямой (бактериостатический) метод учета микроорганизмов. Этот метод дает возможность быстро определить степень обсемененности продукта. С помощью стерильного стекла берут отпечаток с поверхности или с глубины мышц. Препарат подсушивают, фиксируют, окрашивают по Граму или метиленовой синью. Просчитывают число клеток в 10 полях зрения при увеличении объектива микроскопа *90 и определяют среднее число клеток в поле зрения. Считают , что 1 клетка в поле зрения микроскопа соответствует 5х10⁵ кл на 1 г исследуемого продукта.

Этот метод имеет ряд недостатков – нередко образуются микроколонии, которые не распадаются даже при гомогенезации, иногда микробные клетки трудно отличить от примесей другой природы.

В этом случае, когда продукт имеет большую бактериальную обсемененность допустимо приготовить гомогенат продукта и нанести на определенную площадку предметного стекла (1 см², 4см²) 0,1 мл гомогената, равномерно распределить по площадке, препарат высушить, зафиксировать, окрасить по Граму и просчитать в микроскоп при увеличении объектива 90^х. При наличии в поле зрения менее 10 клеток просчитывается 20 полей зрения, 10-50 клеток – 10 полей зрения, а более 50 клеток – 5 полей зрения. Затем определяют среднюю арифметическую численность клеток в поле зрения.

4.5.1.2.1. Рост микробов на предметных стеклах с питательным агаром

Этот метод является быстрым способом определения микробиологического качества многих, особенно жидких продуктов (тузлуков, соусов). На стерильное предметное стекло наносят выбранную питательную среду (РПА, МПА и др.), дают застыть и погружают на несколько секунд в исследуемый материал. Масса жидкости, задержавшейся на пластинке составляет примерно 0,03-0,06 мл. Пластинку термостатируют в стерильных условиях при температуре 22⁰С, применяя меры, предотвращающие высыхание пластинки (в эксикаторе со стерильной водой при слегка приоткрытой крышке). После термостатирования (24-48 час.), пластинки подсушивают, окрашивают метиленовым синим, обсушивают и просчитывают в микроскоп выросшие колонии при увеличении объектива 8^х и рассчитывают результат, учитывая площадь предметного стекла и площадь поля зрения микроскопа (πr²).

Общую обсемененность жидкостей – тузлуков, заливок, воды при малой численности микробов и равномерном их распределении в субстрате, обычно исследуют на мембранных ультрафильтрах. Жидкость определенного объема пропускают через стерильный мембранный ультрафильтр в приборе Зейтца. Фильтр фиксируют в парах формалина, окрашивают раствором эозина, отмывают от излишков краски, высушивают, промасливают иммерсионным маслом и просчитывают в микроскоп при увеличении объектива 90^х и рассчитывают обсемененность продукта, учитывая массу продукта, площадь фильтра и площадь поля зрения микроскопа. Недостатком метода является то, что при подсчете учитываются как живые, так и мертвые клетки, которые не имеют санитарного значения. Метод достаточно быстр в исполнении и пригоден для исследования большого числа образцов.

4.5.1.2.2. Определение санитарно-показательных и патогенных организмов

Более точными показателями санитарного состояния продукта являются санитарно-показательные организмы – бактерии группы кишечной палочки (колиформы), фекальные стрептококки. Численность санитарно-показательных организмов в пищевом продукте показывает степень эпидемиологической опасности пищевого продукта. Чем больше обнаруживается санитарно-показательных микробов, тем более вероятно наличие в нем патогенных бактерий – возбудителей заболеваний.

При выявлении кишечной палочки в мясе крабов анализ выполняется из 10% исходной взвеси. По 1 мл взвеси высевают глубинным методом в чашки Петри, заливают фиолетово-красным агаром с желчью, инкубируют при температуре 35⁰С в течение 24 часов. Колиформы дают на фиолетово-красном агаре колонии красного и розового цвета диаметром 0,5 мм и более.

Для определения титра кишечной палочки в продукте (масса продукта, в которой обнаружена одна кишечная палочка) в три пробирки с ларилсульфаттриптозным бульоном вносят по 1 мл гомогената исследуемого продукта из разведений 1:10, 1:100, 1:1000 в трех повторностях инкубируют при температуре 35⁰С в течение 48 ± 2 час. Через 24 и 48 часов из пробирок где наблюдаются признаки роста микробов (муть, газообразование), делают пересев петлей в желчный бульон с бриллиантовой зеленью и лактозой и бульон ЕС (триптозы и триптиказы 20 г, лактозы 5 г, желчной соли 1,5 г, однозамещенного фосфорнокислого калия 4 г, двухзамещенного фосфорнокислого калия 1,5 г, хлористого натрия 5 г, воды 1000мл). Первый бульон инкубируют при температуре 35⁰С, второй – при температуре 44 ± 2⁰С, при наличии газа материал из пробирки высевают биологической петлей на плотную питательную среду Левина. Посев термостатируют при температуре 35⁰С 24 часа. На питательной среде Левина кишечная палочка дает блестящие колонии правильной круглой формы.

Для определения количества колиформ можно использовать бульон МАККОНКИ с поплавками. Появление газа в пробирках после термостатирования посева при температуре 37 ± 1⁰С в течение 24 и 48 часов считается достаточным подтверждением выявления кишечной палочки. При определении наличия кишечной палочки по методу Наиболее вероятного числа (НВЧ), в сосуды с глюкозо-пептонной средой (ГПС) вносят три пробы по 10 мл, три – по 1 мл и три – по 0,1 мл гомогената из разведений, термостатируют при температуре 37⁰С 24 часа. Появление газа и мути в пробирках считается подтверждением наличия в сосуде кишечной палочки. Считают количество положительных результатов в каждых трех параллельных пробах. Например, в первых трех пробах забродили все три ( 3 ), во вторых пробах забродила одна пробирка ( 1 ), в третьих пробах признаков роста нет ( 0 ), таким образом получается характеристическое число 310, а наиболее вероятное число (НВЧ) по таблице Мак-Креди составляет 43 (Таблица № 8).

При определении кишечной палочки можно пользоваться экспресс-методами с использованием специфических жидких сред: Хейфеца, Коха, среды с хинозобромкрезолпурпуром (ХБ), КОДА. В пробирки вносят определенный объем исследуемого материала термостатируют при температуре 37⁰ С 10-12 час., до 18 час. При росте бактерий группы кишечной палочки среда Хейфеца становится желтой или травянисто-зеленой, среды Коха, ХБ, Кода - приобретают ярко-зеленый, зеленый или желтый цвет.

При сравнении различных методов выявления кишечной палочки при исследовании воды и оборудования, используемого при обработке промысловых беспозвоночных больше других подходит метод НВЧ с использованием бульонов ЛТ (лаурилтриптозный бульон ЕС) состав см. выше). Бульон ЕС дает возможность сократить время анализа на 1 сутки, значительно уменьшается количество используемой среды, облегчается идентификация кишечной палочки.