4.5.1.1. Определение общей микробной обсемененности

Существуют чашечные и прямые методы учета микроорганизмов.

Чашечные методы. В основном используется метод культивирования микробов на твердых питательных средах. При этом производят посев в чашки Петри с последующей заливкой питательным агаром (глубинный метод) или на поверхность агара при помощи биологической петли или шпателя Дригальского (поверхностный метод). В последнем случае соответствующую питательную среду заливают в чашку за сутки до выполнения анализа и подсушивают. Эффективность метода зависит от выбора питательной среды, точности разведения и тщательности переноса материала в чашки. Во избежание термального шока микроорганизмов, вызванного воздействием расплавленного агара при заливке его в чашки, рекомендуется 1 мл соответствующих разведений гомогената вносить в пробирки с расплавленным и охлажденным агаром. После перемешивания инкулома в агаре, последний выливают на поверхность чашек с питательным агаром на морской воде. Посевы инкубируют при температуре 25⁰С от 2 до 7 суток.

Капельный метод или метод прямого посева на чашку Петри с подсушенной средой рекомендуется использовать при обсемененности продукта не более 300 кл/г. В этом случае чашку Петри с залитой питательной средой подсушивают при температуре 50⁰ С, питательную среду делят на несколько секторов и на отдельные сектора наносят по 2 пробы 0,01 мл соответствующего разведения, распределяют по сектору, подсушивают в течение 1 часа, термостатируют 24 часа при температуре 15, 18, 20, 22, 25, 30, 32, 35 и 37⁰ С в зависимости от физиологических особенностей исследуемых микробов. Чаще всего рекомендуется термостатировать посевы при температуре 22⁰ С в течение 72 часов или при температуре 20-25⁰ С в течение 5 суток.

Определение количества бактерий при температуре 20 и 25⁰ С является наиболее ценным показателем начальной порчи, когда преобладают психрофилы, при температуре термостатирования 35⁰ С, их количество обычно в 10 раз меньше. В последнее время рекомендуется использовать предварительное термостатирование при температуре 30⁰ С в течение 24 часов с последующей инкубацией при температуре 22⁰ С в течение 72 часов.

Согласно «Методической инструкции по санитарно-микробиологическому контролю производства кулинарных изделий из рыбы и нерыбных объектов морского промысла», 1978 посевы инкубируют при температуре 30⁰ С в течение 48 часов или при температуре 20-22⁰ С в течение 24 часов и при температуре 37⁰ С в течение 24 час.

При исследовании продуктов, подвергшихся замораживанию, термической обработке или воздействию других факторов, необходимо учитывать возможность присутствия поврежденных клеток. Установлено, что поврежденные клетки не растут на обычных агаровых средах, но способны развиваться на обогатительных средах, особенно Грамотрицательные бактерии. Повреждение клеток обратимо, их способность к размножению восстанавливается в соответствующей питательной среде.

Для роста поврежденных клеток наилучшими условиями является температура инкубации 32⁰С, рН 8, наличие сахарозы. Присутствие глюкозы и лактозы тормозят этот процесс.

При определении общей обсемененности посев обычно проводят из одного или двух разведений на параллельные чашки (не менее двух). После инкубации подсчитывают все колонии, используя лупу, малое увеличение микроскопа или машинки для счета колоний. При окончательном подсчете учитывают разведение и объем пробы. Количество микроорганизмов в отдельных чашках складывают, определяют среднюю арифметическую, результат пересчитывают на 1 г навески (см. выше).

Арифметический метод подсчета бактерий до некоторой степени неточен, поэтому рекомендуется использовать логарифмический метод – подсчет клеток с помощью специальной таблицы. Для определения среднего количества бактерий находят средний логарифм, а затем по таблице количество бактерий соответствующее этому логарифму. (Стандартные методы бактериологических анализов, 1985, Канада)

Таблица 13

Пример расчета

n*104	логарифмы
11	5,04
12	5,08
9	4,95
15	5,18
21	5,32
300	6,48
х=61,3*104	х-5,34 соответствующее число клеток – 22*104

Как видим, конечный результат разнится почти в три раза.

При определении общей бактериальной обсемененности рекомендуются разнообразные питательные среды. Это агар Oxoid C№3, триптонодрожжевой агар с глюкозой, мясопептонный агар, рыбопептонный агар. Для учета общего количества аэробов рекомендуют использовать агар Югона, содержащий 0,5% декстрозы, которая способствует лучшему росту аэробов. Для подсчета организмов образующих H₂S, используют РПА с добавлением сульфата железа. Посевы инкубируют при температуре 20⁰С в течение 4-х суток. Колонии вырастают под агаром и имеют черный или серый цвет. Для быстрого выявления бактерий с протеолитическими свойствами используют среду, состоящую из смеси агара и желатина. В стерильные чашки Петри вносят стерильную питательную среду №1 (РПА), на поверхность застывшей среды наносят 0,1 мл соответствующего разведения исследуемого материала и распределяют стерильным шпателем Дригальского. Затем поверхность каждой чашки заливают 2,5 мл питательной среды №2 (РПЖ) и быстро распределяют равномерным слоем. Инкубируют посев при температуре 20⁰С в течение 3-х суток. Сначала считают общую бактериальную обсемененность, затем чашки заливают 10 мл 5% лимонной кислоты для осаждения оставшегося желатина и через 15 минут подсчитывают колонии с зоной просветления (протеолитические). Непосредственный подсчет колоний протеолитических бактерий, присутствующих на беспозвоночных, представляет большой интерес для установления сроков их холодильного хранения.

Для подсчета плесневых грибов рекомендуется использовать питательный агар с 0,5% NaCl и антибиотиками, среду Чапека или Сабуро.