4.3. Микробиологический анализ рыбы-сырца.

4.3.1. Определение общей численности бактерий (мафам)

1.Отбор проб и подготовка к анализу

Образцы проб рыбы-сырца отбирают из разных мест обследуемой партии. Партией считается продукция одного наименования и сорта, выработанная в один день и смену, упакованная в таре одного типа, оформленная одним документом о качестве продукции. Отбор проб проводится стерильным инструментом в стерильную емкость. Рыбу отбирают из трех вскрытых транспортных упаковок: мелкой рыбы не менее 10 экземпляров, крупной не мене трех экземпляров.

4.3.1.1. Определение общей обсемененности рыбы-сырца бактериями чашечным методом (метод предельных разведений, метод Коха)

Взвешивают стерильную ступку со стерильным песком, во взвешенную ступку помещают навеску рыбы около 10 г, взвешивают еще раз, по разнице весов определяют взятую навеску. Навеску тщательно растирают с песком, соблюдая правила асептики, допустимо приливать в ступку немного стерильной воды из колбы, приготовленной для разведения. Растертую рыбу переносят в колбу, содержащую 90 мл стерильной воды. Колбу с навеской тщательно размешивают 10-15 минут, дают смеси осесть и выполняют разведение материала в 10³, 10⁴,10⁵ раз. Стерильной пипеткой по 1 мм соответствующего разведения перенося в стерильные чашки Петри, заливают остуженным до 45⁰С РПА, пишут данные об анализе на крышке чашки, после застывания агара чашку помещают донышком кверху в термостат. Посев термостатируют 18-24 часа при температуре 37⁰С. После термостатирования просчитывают все выросшие колонии. Не учитывают чашки, в которых обнаружен рост ползущих колоний, маскирующих более 1/3 чашки.

Общая микробная обсемененность рыбы-сырца не должна превышать 5·10⁴ микробных клеток на 1 г, после разделки и мойки она не должна превышать 1·10⁴ кл/г или на 1 см².

Общая обсемененность рассчитывается по формуле:

К = а*b*с кл/г где

d

К – количество клеток в 1 грамме

а – число колоний в чашке

b – разведение

с – объем смывной воды мл.

d – масса продукта в граммах

4.3.1.2. Определение общей обсемененности методом микропластинок (метод Фроста)

Этот метод модификация чашечного метода. Сущность его состоит в замене дорогих и громоздких чашек Петри предметными стеклами.

На чистом обезжиренном предметном стекле отмечают площадку в 1см² восковым карандашом, препятствующим растеканию жидкости.

Градуированной пипеткой 1мл разведения вносят в сухую стерильную пробирку, которую помещают на 2 мин. на водяную баню при температуре 45⁰С затем в эту пробирку вносят 1 мл расплавленного РПА, при температуре 45- 48⁰С, смесь хорошо перемешивают и ставят на 2 мин на водяную баню с той же температурой. Градуированной пипеткой на пластинку наносят 0,03 мл смеси. Смесь тщательно и равномерно распределяют по площадке профламбированной охлажденной петлей. Стекла оставляют на 30 сек в горизонтальном положении, чтобы смесь застыла. Стекла с застывшей средой помещают во влажную камеру, установленную в термостате, и выдерживают при температуре 37⁰С в течение 17-18 часов (влажной камерой может служить эксикатор или другой плоский сосуд со стерильной дистиллированной водой. Для удаления испарившейся влаги крышка должна быть слегка приоткрыта). После термостатирования микропластинки подсушивают 20мин при температуре 60-70⁰С и окрашивают 2 мин метиленовой синью, приготовленной по способу Хейфеца. С обратной стороны стекла краску смывают небольшой струей воды. Окрашенные микропластинки подсушивают в шкафу 5 мин. Микроколонии на пластинках просчитывают в 10 полях зрения при увеличении объектива микроскопа 10. Можно пользоваться любым подходящим увеличением микроскопа. Результаты близкие к результатам чашечного метода получают при наличии в одном поле от 1 до 20 микроколоний.

Расчет результата:

1. Определить среднее число колоний в поле зрения микроскопа по 10 полям:

_

n = ∑n/ 10

2. Определить число колоний на площади микропластинки:

S₁ – n , где

1см² – х

S₁ = πr², 1 см² – площадь мазка

S₁ – площадь поля зрения микроскопа.

3. Полученный результат необходимо пересчитать с учетом разведения, объема использованной жидкости и взятой навески.