ФОРМА 1

1. Вид науки: (04) Биология и технологии живых систем,

2. Ф. И. О. участников проекта (полностью):

2.1. Данные о руководителе проекта: Елсукова Елена Ивановна, телефон раб. - 8(391)217-17-28; тел. моб. – 8(983)-166-72-81; e-mail – elsukova@kspu.ru

2.2. Ф.И.О. исполнителей проекта: Медведев Леонид Нестерович., Мизонова Олеся Владимировна, Замяткина Маргарита Александровна, Тайдонов Сергей Валерьевич, Труханенко Лариса Васильевна, Макарская Галина Владимировна, Тарских Светлана Вениаминовна

3. Название проекта - Механизмы возрастных деструктивных изменений бурой жировой ткани и естественные пути их сдерживания

4. Содержание проекта.

4.1. Научная проблема

Проект является продолжением исследований регулируемого термогенеза в бурой жировой ткани, проводимых в 2009-2012 г.г.. Эта специфическая для млекопитающих структура, эволюционно предназначенная для сохранения температурного гомеостаза при низких температурах среды, для разогрева при выходе из торпидных состояний [Медведев, Елсукова, 2002; Canon, Nedergaard, 2004], в последние годы все чаще привлекает внимание в качестве перспективной обладающей высокой емкостью «ловушки» для глюкозы и СВЖК. Нарушения гомеостатирования этих метаболитов – лептино и инсулинорезистентность, закономерно развертывающиеся во второй половине онтогенеза - приводят к развитию сахарного диабета 2 типа, атеросклероза, других проявлений метаболического синдрома, существенно ограничивающих продолжительность жизни [Valverde, 2010]. Результаты нашей работы, полученные в ходе выполнения прежних проектов, подтвердили сдерживающую роль базального термогенеза бурого жира в росте висцерального жира, в развитии гипергликемии и гипертриглицеридемии [Замяткина и др, 2011; Elsukova et al., 2012].

В онтогенезе интенсивность термогенеза в БЖТ снижается, особенно значительно в период полового созревания [McDonald et al, 1998]. В дальнейшем в ткани накапливаются деструктивные изменения – уменьшается количество клеток, митохондрий, что приводит к необратимому ослаблению термогенеза [Valle et al., 2008]. Индивидуальные темпы метаболического старения ниже у экспериментальных животных с более интенсивным базальным термогенезом [Замяткина, 2010; Замяткина и др 2011]. Таким образом, своевременная реактивация БЖТ могла бы стать средством, замедляющим развитие метаболического синдрома и преждевременного старения. Задача поддержания повышенной термогенной активности бурого жира в силу свойственных ему высокой тканевой пластичности и потенциала клеточной пролиферации представляется более решаемой нежели чем преодоление саркопении, также ограничивающей возможности регуляции глюкозы, СВЖК и холестерина в крови. Как показано испанскими исследователями [Valle et al., 2007, 2008] и нами [Elsukova et al, 2012], калорийно ограниченный рацион сдерживает возрастные изменения разных составляющих термогенного потенциала бурого жира и, возможно, даже увеличивает его за счет появления бурых адипоцитов в белом жире. Имеются косвенные указания на повышенный термогенный резерв БЖТ при длительных тренировках на выносливость экспериментальных животных [Ravussin, Kozak, 2009]. По-видимому, физическая тренировка способствует увеличению пула клеток-предшественников, которые у бурых адипоцитов и мышечных волокон оказались общими. Эффективность, направленность воздействий на термогенез бурого жира напрямую зависит от правильного представления о механизмах, ограничивающих его термогенный потенциал.

Молекулярные механизмы как деструктивных изменений так и процессов клеточного обновления в буром жире практически не изучены. В других тканевых системах интенсивность свободнорадикального окисления является тем ключевым фактором, величина которого переключает процессы в клетках либо в режим интенсивной репарации, усиливает клеточную пролиферацию, либо запускает апоптоз [Голубев, 2006]. В буром жире исследования источников супероксид анион радикала и других активных форм кислорода, антиоксидантных систем, обеспечивающих их нейтрализацию, только разворачиваются [Petrovic et al, 2006; Shabalina et al., 2006; Spasic et al., 1993], однако имеющиеся на сегодняшний день результаты фрагментарны и не всегда однозначны. Нашим коллективом впервые разработан хемилюминесцентный метод оценки валовой продукции супероксид анион радикала клеточными фракциями бурой жировой ткани; показано, что вклад в продукцию супероксид анион радикала вносят не только адипоциты, но и представленные в микроокружении фагоциты, причем выход супероксид анион радикала снижается при интенсивном термогенезе [Елсукова и др, 2011].

Основываясь на предварительных результатах нашей работы, можно предположить, что функциональное снижение термогенеза бурого жира в период взросления приводит к усилению свободнорадикального окисления, развитию деструктивных изменений в ткани, повышенной миграции туда макрофагов. Развивающийся хронический воспалительный процесс приводит к нарастанию гибели адипоцитов и предшественников.

2. Цель проекта – оценить возможное участие свободнорадикальных процессов в деструктивных изменениях термогенного потенциала бурой жировой ткани в постнатальном онтогенезе

Задачи:

1. Изучить возрастные особенности спонтанной и латекс-индуцированной люцигенинзависимой хемилюминесценции клеток бурой жировой ткани мышей

2. Сопоставить спонтанную и латекс-индуцированную люцигенинзависимую хемилюминесценцию в бурой жировой ткани, показатели ее термогенного потенциала у мышей, питающихся ed libitum и в условиях калорийно ограниченного питания

3. Сопоставить спонтанную и латекс-индуцированную люцигенинзависимую хемилюминесценцию в бурой жировой ткани, показатели ее термогенного потенциала в динамике тренировки мышечной выносливости у мышей при разных температурных режимах

3. Новизна поставленной цели (задачи)

Задача выяснения роли свободнорадикального окисления в патогенезе возрастного ослабления термогенеза бурого жира поставлена впервые. Имеющиеся немногочисленные исследования касаются источников свободных радикалов в митохондриях адипоцитов, проводятся с использованием традиционных энзимологических методов и не дают ответа на вопрос о валовой продукции активных форм кислорода в преадипоцитах и в адипоцитах разной степени зрелости, в клетках микроокружения. На сегодняшний день также полностью отсутствуют сведения о влиянии температуры среды, калорийно ограниченного рациона и его миметиков, а также двигательных режимов, относимых к геропротекторным воздействиям, на интенсивность генерации активных форм кислорода в буром жире. Знание молекулярно-клеточных механизмов онтогенетических изменений термогенеза необходимо для направленной разработки или скрининга уже существующих препаратов, предназначенных для эффективной коррекции метаболического синдрома и других проявлений преждевременного старения.

3. Предполагаемые методы, подходы и общий план выполнения работ;

Надежным методом оценки скорости продукции свободных радикалов клеточными суспензиями является регистрация в них хемилюминесценции, усиленной с помощью специальных люминофоров. Использование в качестве люминофора люцигенина позволяет с высокой специфичностью оценивать образование клетками супероксид анион радикала, который запускает большинство цепей свободнорадикального и перекисного окисления. Для получения клеточной суспензии бурого жира будет использована традиционная методика инкубации кусочков ткани с коллагеназой. Выделение зрелых адипоцитов и стромально-васкулярных элементов будет проведено с помощью дифференциального центрифугирования. Регистрация хемилюминесценции будет проведена на 36-канальном хемилюминометре CL (Красноярск СКТБ «Наука»). Для выяснения вклада в продукцию супероксида тканевых макрофагов кроме спонтанной хемилюминесценции будет регистрироваться латекс-индуцированная хемилюминесценция стромально-васкулярной фракции. Эта часть работы по проекту будет выполняться на базе лаборатории иммунологии Международного центра экстремальных состояний организма СО РАН старшим научным сотрудником канд. биол. наук Макарской Г.В., инженером Тарских С.В. и магистрантом Тайдоновым С.В.

Содержание и подготовка экспериментальных животных будут осуществляться на базе лаборатории экспериментальной физиологии факультета биологии, географии и химии КГПУ им. В.П. Астафьева Л.В. Мизоновой О.В., Замяткиной М.Н., Труханенко Л.В. Условия содержания – температура помещения 23±3 ˚С, полноценный гранулированный комбикорм ПК-120-1 для лабораторных грызунов (БиоПро, Новосибирск).

Режим калорийно ограниченного питания и режим тренировок на выносливость стандартные [Асташкин и др., 2010]. Первый достигается предоставлением опытным животным в индивидуальных клетках корма в количестве 60% от предварительно определенного потребления корма контрольными животными. Вызванный ограничением кормления дефицит витаминов и микроэлементов компенсируется добавлением в питье витаминно-минерального премикса Дельта-Фидс (БиоПро, Новосибирск). Продолжительность калорийно ограниченного питания перед определением свободнорадикального окисления в буром жире - 3-4 недели. Глубина энергодефицита оценивается по соматометрическим показателям, содержанию абдоминального жира, уровню в крови глюкозы и триглицеридов. Возрастные группы мышей – 0,5; 1,5, 5, 10 мес.

Тренировка физической выносливости достигается ежедневным подвешиванием мышей на веревке диаметром 1 мм (высота 1 м над опорой). Продолжительность виса – до отказа. Эффективность тренировочного процесса оценивается по увеличению времени виса.

План работы

Сроки
Апрель-июнь	Хемилюминесцентный анализ клеточных фракций бурого жира аутбредных мышей ICR разного возраста (0,5; 1,5, 5, 10 мес.), сопоставление показателей светосумм спонтанной хемилюминесценции с показателями интенсивности термогенеза, сопоставление светосумм латекс-индуцированной хемилюминесценции и клеточности бурого жира.
Май	Подготовка докладов на Съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока, направление статьи в «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» (Изд-во РАМН, список ВАК)
Сентябрь	Подготовка статьи и направление в журнал «Биомедицина» (Изд-во РАМН, список ВАК)
Август- сентябрь	Хемилюминесцентный анализ клеточных фракций бурого жира мышей ICR, получающих калорийно ограниченный рацион.
Октябрь	Подготовка докладов на Международную молодежную конференцию в Екатеринбурге. Секция – биомедицина.
Октябрь	Хемилюминесцентный анализ клеточных фракций бурого жира мышей ICR в ходе тренировки мышечной выносливости
Ноябрь-декабрь	Анализ результатов, предоставление отчета

5. Ожидаемые конкретные научные результаты

Ожидается экспериментальное подтверждение гипотезы об активации свободнорадикальных процессов при функциональном снижении термогенеза в период взросления (0,5 – 1 мес у мышей) с последующим нарастанием в ткани макрофагов и формированием очага хронического воспаления.

По результатам проекта планируется направить 2 статьи в журналы РАМН «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» и «Биомедицина», подготовить 2 устных доклада на Съезде физиологов Сибири и Дальнего востока (июнь 2012), 2 устных доклада на международной молодежной научной конференции по современным проблемам биомедицины в Екатеринбурге (ноябрь 2012).

5. Имеющийся научный задел

В коллективе накоплен большой опыт по выделению БЖТ и оценке ее термогенного потенциала. Отработаны методы выделения и фракционирования клеток бурого жира, оценки их функционального состояния. На базе сектора иммунологии МЦЭСО КНЦ СО РАН разработан метод оценки валовой спонтанной и латекс-индуцированной продукции супероксид анион радикала краткосрочными культурами клеток бурого жира.

5. Список основных публикаций коллектива, наиболее близко относящихся к проекту;

Медведев Л.Н., Елсукова Е.И. Бурая жировая ткань. Молекулярно-клеточные механизмы регулируемого термогенеза. – Красноярск: Изд-во «Амальгама», 2002. – 528 с.

Медведев Л.Н., Елсукова Е.И. Бурая жировая ткань человека // Успехи физиологических наук – 2002. – Т.33. – С. 17-29.

Elsukova E.I., Medvedev L.N., Mizonova O.V., Taidonov S.V. Effect of calorie restricted diet on brown adipose tissue in mice // Bulletin of experimental biology and medicine // Bulletin of experimental biology and medicine. – 2012. – Vol.152 – P. 286-288.

Елсукова Е.И., Макарская Г.В., Тайдонов С.В., Тарских С.В. Люцигенин-зависимая хемилюминесценция клеток бурой жировой ткани. // Международная конференция Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии (сборник трудов).- Казань, Казанский приволжский федеральный университет.- 2011.- С.207-209.

Замяткина М.А. Бурая жировая ткань в лабораторных моделях замедленного старения. // Труды Томского государственного университета. Сер. Биологическая: Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии.– 2010. – Т.275. – с.199-201

Замяткина М.А., Селиванова Ю.В., Елсукова Е.И. Термогенез в бурой жировой ткани и метаболические показатели крови мышей. // Международная конференция Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии (сборник трудов).- Казань, Казанский приволжский федеральный университет.- 2011.- С.239-241.

Мизонова О.В., Елсукова Е.И. Влияние калорийно ограниченного рациона на жировые ткани мышей // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине Т.2.- Санкт-Петербург, Изд-во Политехнического университета.- 2011.- С.239-241.

4.8. Оригинальность проекта, его инновационный характер.

Проект направлен на выяснение молекулярно-клеточных механизмов возрастных нарушений термогенеза что является первым шагом к направленной разработке и использованию естественных путей профилактики метаболического синдрома, а также к направленной разработке и скринингу уже существующих препаратов, предназначенных для эффективной коррекции метаболического синдрома и других проявлений преждевременного старения.