Методы выделения, культивирования и

Идентификации микроорганизмов (вопрос 18)

В естественных условиях микроорганизмы существуют в смешанных популяциях, ассоциациях и пр. Для установления этиологического фактора инфекционного заболевания бактериологическим методом, требуется выделение микроба в чистом виде. Для этого применяют различные питательные среды из перечисленных выше групп (транспортные, обогащения, элективно-диагностические, дифферернциально-диагностические и пр.) в определенном порядке.

Вначале делают посев исследуемого материала (кровь, фекалии, моча, соскобы розеол, мокрота, носоглоточные смывы и пр.) после определенной его обработки как обычно на среды обогащения и элективно-диагностические (при необходимости перемещения посевов на большие расстояния применяют среды консервирования). Засеянные питательные среды выдерживают при температуре, оптимальной для данного микроба (обычно в термостате при 37⁰ С).

После экспозиции просматривают чашки Петри и выбирают подозрительные колонии (по цвету, форме, размеру, краям колонии и пр. - это диагностические признаки), которые пересевают на скошенный агар, с целью получения чистой культуры в достаточном для дальнейшей работы количестве. Со скошенного агара делают пересев на дифференциально- диагностические среды.

При исследовании на энтеробактерии вводят дополнительные элективные среды (Олькеницкого и пр.), откуда делают пересевы на дифференциально-диагностические среды, с целью определения свойств выделенной культуры: ферментативных, протеолитических, бродильных, токсигенных и других, что является основой в определении вида, подвида и др. качеств исследуемой культуры.

Такая схема выделения микроба и идентификации может длиться 3-4 дня или более в зависимости от вида микроба (свойств). Конечным результатом является выделение штамма и установление его вида, а возможно – серовара, фаговара, антибиотикочувствительности и пр., т.е. проводится не только постановка этиологического диагноза, но и даются некоторые рекомендации для лечения конкретных инфекционных больных.

Чистая культура - это потомство одной микробной клетки, выращенное на питательной среде, т.е. культура моноклона.

Штамм - это чистая культура определенного вида микроба, выделенная в данное время из конкретного материала.

Вид – это категория, обозначающая микроорганизмы, имеющие сходный генотип и несколько различающиеся по фенотипу.

Род - это собирательный термин, обозначающий сходные по генотипу и несколько различающиеся по фенотипу (свойствам) микроорганизмы нескольких видов.

Для культивирования микроорганизмов необходимы не только питательные среды, но и условия изоляции пассируемых микробов от загрязнения.

Это достигается стерильными условиями культивирования.

Посев инокулята

В бактериологической практике нет малозначащих этапов, которые можно исполнить небрежно. Для конечного результата является очень важным: как и в какие сроки был взят материал для исследования и где он был засеян (у постели больного или в лаборатории).

Если материал перевозят в лабораторию, то важно в какие сроки он будет доставлен, каким образом и когда будет сделан посев.

Для каждой инфекции существует инструктивно-методическая литература по режиму и срокам доставки, способам забора материала и пр.

Первым этапом бактериологических исследований является посев исследуемой пробы на элективно-диагностические и среды обогащения. Питательные среды следует выбирать в зависимости от предполагаемых возбудителей и от типа материала (кровь, фекалии и пр.).

Посев проводят петлей (материал наносят у края чашки, затем рассеивают по секторам), шпателем (материал наносят на поверхность агара, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его в поверхность среды), тампоном (тампон с материалом вносят в чашку, делают площадку и круговыми движениями чашки и тампона втирают материал в поверхность среды) и пр.

Для разных целей посевы, например, делают штрихами. Карандашом расписывают сектора на дне чашки и в каждом секторе посевы делают от края чашки к середине штрихами, которые не должны перекрещиваться (обычный посев). Иногда делают посев газоном: 1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура) наносят пипеткой на агар и тщательно распределяют по всей поверхности, покачивая чашку. Надписи делают на чашках со стороны дна.

При пересеве из пробирки в чашку Петри, вначале берут пробирку с материалом в левую руку между указательным, большим и средним пальцами, положив ее на ребро кисти. Петлю берут в правую руку как "писчее перо", прокаливают и после остужают внутри пробирки. Пробку пробирки зажимают между мизинцем и ладонной поверхностью кисти правой руки и вынимают на огнем спиртовки, обжигая края пробирок. Вводят петлю внутрь пробирки, прикасаются к краю питательной среды для охлаждения петли, а затем набирают материал с поверхности среды, не повреждая агар.

Затем петлю с материалом вынимают из пробирки, быстро над огнем спиртовки закрывают пробирку пробкой и ставят ее в штатив, немного приподнимают крышку у чашки левой рукой, вводят внутрь чашки петлю, делают небольшую площадку, втирая материал, а затем, поворачивая чашку, засевают штрихами по секторам чашки. Петлю вынимают и быстро закрывают чашку, а петлю стерилизуют над огнем и ставят в штатив.

При посеве из пробирки в пробирку, обе держат в левой руке наклонно, как описано выше. Петлю держат как обычно, прокаливают, затем одновременно вынимают пробки из обеих пробирок, как описано выше. Петлю вводят в пробирку с посевом, набирают культуру и вынимают, вводят в другую пробирку и производят посев штрихами от нижнего края косяка к верхнему.

Если засевают в жидкую среду, то петлю держат некоторое время в этой среде, чтобы культура могла распределиться в жидкости.

При посеве в полужидкий агар делают петлей укол в эту среду. Затем петлю вынимают, закрывают пробками обе пробирки над огнем, стерилизуют петлю и ставят в штатив, а затем ставят и пробирки.

При посеве на скошенный агар, делают штрихи, начиная с нижнего края скошенного агара, с конденсационной воды (если она есть). При посеве на среды Ресселя, Олькеницкого и Клиглера после штрихов делают укол внутрь агара.

При посеве жидкого материала пользуются пипетками или петлей. При посеве пробы для количественного учета микроорганизмов наносят 1 мл материала пастеркой на чашку и шпателем втирают его в поверхность первой чашки, не прожигая шпатель, переносят его во вторую чашку и также втирают, затем и в третью. Лишнюю жидкость отсасывают из чашек пипетками.

Посевы инкубируют в термостате при 37⁰ С (обычно) или при температуре, оптимальной для культуры. Срок инкубации зависит от скорости деления клеток, например, бактерии кишечной группы обычно растут 18-24 ч, холерный вибрион на пептонной воде - 6 ч, другие микробы, например, лептоспиры - до 5-6 дней и т.д.

Изучение изолированных колоний

По истечение определенного срока на засеянных чашках микробы формируют колонии разной морфологии.

Колония - это видимое невооруженным глазом характерное скопление микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде как потомство от одной из засеянных микробных клеток.

Это второй этап бактериологического анализа. Морфология выросших колоний - это важный культурально-диагностический признак. Колонии микробов изучают в проходящем свете с помощью лупы или невооруженным глазом. Рассматривают чашку со стороны дна.

Оценивают морфологию по определенным критериям:

• размер колонии (микроскопический, мелкий, средний, гигантский),

• форма колоний (круглые, неправильные, отросчатые и пр.),

• профиль колоний (плоский, выпуклый, куполообразный, блюдцеобразный и пр.),

• характер поверхности (гладкая, шероховатая, морщинистая, изрезанная и пр.),

• прозрачность колонии (прозрачная, мутная, полупрозрачная),

• пигмент (желтый розовый красный, кремовый, перламутровый и пр.),

• структура колонии (гомогенная, зернистая, волокнистая и пр.),

• края колонии (ровные, фестончатые, изрезанные, волнистые, бахромчатые и пр.),

• консистенция колонии (мягкая, сухая, слизистая, сметанообразная, крошковидная),

тип колонии (круглые, влажные, выпуклые – S-тип, сухие, шероховатые, края неправильные – R-тип, тягучие, слизистые, валик вокруг колонии – М-тип)