(Вопрос 6)

Фазово-контрастная микроскопия. Этот вид микроскопирования требует особый конденсор (КФ-1, 4) и специальный осветитель (ОИ-7, ОИ-19 и др.), при использовании обычного микроскопа. Исследование в световом микроскопе нативного неокрашенного микроорганизма практически невозможно. Для этого применяют фазово-контрастное микроскопирование, когда прозрачные объекты приобретают высокую контрастность изображения. Оно может быть позитивным, когда на светлом поле видно темно изображение объекта, и может быть негативным, когда на темном поле видно светлое изображение объекта.

При микроскопировании этими способами освещение должно отвечать требованиям, предъявляемым при световой, фазовой, темнопольной микроскопии, микрофотографирова-нии.

(Вопрос 7)

Люминисцентная микроскопия. Люминисценция - это свечение веществ в результате воздействия световым или другими видами излучений. Если освещать люминисцирующий объект ультрафиолетовым светом, то он будет излучать лучи разного цвета. Поскольку таких самосветящихся объектов достаточно мало, то в работе следует применять «вторичную» люминисценцию, т.е. предварительное мечение объекта специальными люминисцирующими красителями - флюорохромами. Обычно флюорохромами метят антисыворотки и тогда свечение собирается вокруг гомологичных по специфичности микробов в виде светящегося ободка. Люминисцентная микроскопия занимает определенную нишу в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, позволяя исследовать микроорганизмы в живом состоянии и малых концентрациях - непосредственно в исследуемом материале

Электронная микроскопия. Для проведения электронной микроскопии применяют специальные, так называемые электронные микроскопы. В электронном микроскопе вместо световых волн используют поток электронов, длина волн которых меньше длины света в 100000 раз. Электронный микроскоп дает увеличение в 100000-200000 раз. Разрешающая способность электронного микроскопа 0,1-0,2 нм. Источником электронов в таком микроскопе является электронная пушка (электронно-лучевая трубка с катодом в виде раскаленной нити и анодом - цилиндром). Электронный микроскоп применяют для изучения тонкого строения микроорганизмов, вирусов, прионов и др. субмикроскопических структур и объектов. Это микроскоп просвечивающего типа. Существуют электронные микроскопы сканирующего типа, с помощью которых проводят изучение рельефного строения внешней поверхности субмикроскопических объектов.

Приготовление мазка для окрашивания (вопрос 8)

Изучение микробов в окрашенном состоянии имеет несколько положительных сторон: широкая доступность практике, простота техники обработки, безопасность микроскопии, возможность более подробного изучения их структуры и морфологии.

Приготовление окрашенного препарата имеет несколько последовательных стадий: приготовление мазка, высушивание и фиксирование его, окраска мазка.

Подготовка предметных стекол и мазков. Первым этапом в процессе приготовления мазка является подготовка предметных стекол. Новые стекла кипятят в 1 % растворе соды, промывают водой.

Стекла бывшие в употреблении помещают на 2 ч в концентрированную серную кислоту, после чего кипятят в щелочи (сода, едкий натр), затем промывают водой. Готовые стекла хранят в склянке с притертой пробкой в 90 % спирте. Если они не хранились в спирте, их обезжиривают, например, натирая кусочком сухого мыла, а затем протирают чистой марлей. Капля воды на обезжиренном стекле растекается по поверхности.

Мазок - это небольшая часть исследуемого материала, тонким слоем нанесенная на предметное стекло, с целью последующего изучения морфологии и структуры микроорганизмов. В качестве материала может быть использована кровь, колонии микробов, нативный материал от больных и пр.

Если мазок готовят из бактериальной культуры, выросшей на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю 0,85 % раствора хлорида натрия.

Материал на бактериальной петле вносят в каплю жидкости и круговыми движениями растирают и распределяют его по предметному стеклу в виде круглого или овального мазка, диаметром 1-2 см².

Материал из гноя или мокроты забирают с помощью петли или препаровальной иглы. Выбирают гнойные кусочки и наносят в центр предметного стекла.

Сверху на предметное стекло помещают второе предметное стекло, оставляя свободным левый край.

Взяв за свободные концы предметных стекол, раздвигают их в стороны. В результате чего получаются два мазка на обоих стеклах.

Кровь наносят на предметное стекло в виде капли недалеко от левого края.

Быстро берут второе предметное стекло в правую руку и прикладывают его к нижнему стеклу под углом в 45⁰, затем под этим же углом придвигают к капле крови, которая растекается по его нижнему краю. Плотно прижимая верхнее стекло под таким же углом к нижнему, быстро продвигают его к правому краю нижнего стекла.

На нижнем стекле получается равномерный мазок крови, готовый для светового микроскопирования.

Мазок-отпечаток. Это прикладывание среза органа животных или от человека, во время оперативного вмешательства, к предметному стеклу.

Забор бактериальной массы для приготовления мазка. Микробы извлекают из посевов с помощью бактериальной петли. Это платиновая проволока - один конец которой загнут в виде маленького колечка, а другой вставлен в петледержатель, который и является ручкой. Петлю стерилизуют в пламени спиртовки, после чего ее следует остудить, прикоснувшись к незасеянной части питательной среды перед взятием петлей культуры.

Пробирку с посевом помещают в левую руку сверху на ребро ладони между большим, указательным и средним пальцами в несколько наклонном положении. Должна быть видна вся поверхность питательной среды с культурой. Петлю берут в правую руку как писчее перо. Далее зажимают пробку пробирки правой рукой между мизинцем и поверхностью ладони, прилежащей к мизинцу, и вытаскивают ее над пламенем спиртовки. Обжигают края пробирки над пламенем и вносят стерильную петлю в пробирку, захватывают колечком петли небольшое количество культуры и не прикасаясь к стенке пробирки вынимают петлю. Края пробирки слегка обжигают и закрывают пробкой. Петлю с культурой бактерий вносят в каплю жидкости на предметном стекле и распределяют в виде равномерного мазка. Петлю прожигают и ставят на место, а затем и пробирку с культурой.

Далее проводят подсушивание мазка в токе теплого воздуха горящей спиртовки или при комнатной температуре. Перегрева не допускать. Затем мазок фиксируют, трижды проводя предметное стекло с мазком над пламенем, делая круги диаметром 3 см. В результате этого микроорганизмы должны погибнуть, плотно прикрепившись к стеклу, становясь при этом восприимчивыми к окрашиванию.

Возможна фиксация мазка с помощью химических растворов, потому. что не все препараты можно фиксировать над пламенем (споры, пили, жгутики и пр.). Фиксатор наливают на мазок, либо в раствор погружают предметное стекло с мазком. Наибольшее распространение получили фиксаторы - этиловый спирт (10-15 мин) и смесь Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира), фиксация 10-15 мин. Приготовленные мазки подвергают окрашиванию.