Тема 2: предварительное исследование. Аналитический скрининг

I. Мотивация цели

Судебно-химическая экспертиза складывается из предварительного и подтверждающего исследований. Цель предварительного исследования - вы­явить наличие или отсутствие лекарственных средств в органических экстрак­тах с использованием скрининговых методов.

Овладение теоретическими основами и практическими навыками прове­дения аналитического скрининга необходимы провизору для последующей специализации в области судебно-химической экспертизы и клинической ток­сикологии.

II. Цель самоподготовки

Используя учебный и учебно-методический материал по токсикологиче­ской химии, а также знания и умения по базисным дисциплинам, изучить мето­ды предварительного разделения и обнаружения лекарственных средств.

III. Исходный уровень знаний

Студенты должны знать:

• физико-химические методы, используемые для разделения и обнаружения химических соединений, - хроматография в тонких слоях сорбента.

Студенты должны уметь:

• выполнять хроматографирование в тонких слоях сорбента;

• выполнять обработку хроматограммы цветореагентами и идентифицировать исследуемые соединения;

• рассчитывать абсолютную (Rf) и относительную (Rs) хроматографическую подвижность исследуемых соединений.

IV. План изучения темы

На занятии рассмотреть:

• способы предварительного обнаружения групп лекарственных соединений, экстрагируемых из кислой среды;

• условия ТСХ-скрининга лекарственных соединений кислотного и основного характера, способы обнаружения лекарственных средств на хроматограмме.

V. Рекомендуемая литература

1. Швайкова М.Д.. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С. 142-241.

2, Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств: Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств / Под ред. Б.Н. Изотова. - М.: Мысль, 1993. - 250 с.

3. Крамаренко В.Ф, Токсикологическая химия. - Киев: Выща школа, 1989. - С 20-22, 204-295,

4. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - Киев: Выща школа,

1982.-0.9-27,121-197.

5. Белова А.В. Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии. - М.: Медицина, 1976. - С. 56-60.

6. Конспект лекций.

VI. Блок информации

Аналитический скрининг

Это научно обоснованная система поиска неизвестного вещества, когда в процессе последовательных операций поэтапно «отсеиваются» отдельные группы веществ и индивидуальные соединения.

Слово «скрининг» в переводе с английского означает «отсеивание».

Аналитический скрининг эффективен при диагностике комбинированных отравлений, а также при ненаправленном анализе.

Требования к скрининговым методам:

• универсальность;

• специфичность для определенной группы веществ;

• высокая чувствительность (10"⁸ -10 "^!Ог в пробе);

• экспрессность и простота исполнения;

в возможность выполнения серийных анализов;

• возможность стандартизации и совершенствования методов за счет использования новых материалов, оборудования, расширения списка анализируемых соединений.

Общий скрининг позволяет прово­дить групповую идентификацию при иссле­довании веществ, отличающихся по хими­ческому строению и относящихся к различ­ным фармакологическим группам.

Частный скрининг направлен на об­наружение веществ внутри группы и иден­тификацию ее отдельных представителей.

К скрининговым методам относятся:

• хроматографические,

• спектральные,

• иммунохимические.

ТСХ - скрининг

В ТСХ-скрининге используют системы рас­творителей:

• для алкалоидов опия частная система — этилацетат — метанол - 25% раствор гидроксида аммония (17:2:1);

• для веществ из группы наркотических и одурманивающих средств, а также в экспресс-анализе острых интоксикаций - толуол - ацетон - этанол - 25% раствор гидроксида аммония (45:45:7,5:2,5).

Детектирование (проявление) соедине­ний проводят последовательно. Для фракции А:

• 5% раствор сульфата ртути в концентрированной серной кислоте – барбитураты (белые зоны);

• 0,01% раствор дифенилкарбазона (ДФК) в хлороформе — барбитураты (сине- фиолетовые зоны);

• 10% раствор хлорида железа (III) - производные пиразолона-5 (синие зоны, антипирин - красно-оранжевая зона);

• реактив Драгендорфа - вещества, содержащие третичный азот (оранжевые зоны).

• для барбитуратов частная система — хлороформ — н-бутанол — 25% раствор

• для веществ кислотного, нейтрального и слабо основного характера, содер­жащихся в «кислом» извлечении (фракция А), - хлороформ-ацетон (9:1);

• для веществ основного характера, содержащихся в «щелочном» извлечении (фракция Б), - диоксан - хлороформ - ацетон - 25% раствор гидроксида ам­мония (47,5:45:5:2,5);

гидроксида аммония		(70:40:5);
Хроматографическая подвижность I соединений фракции Б в общей системе растворителей на пласти­нах Silufol
Название лекарственного средства			R		Rs
Пахикарпин			0,12		0,23
Атропин			0,15		0,29
Эфедрин			0,18		0,35
Хинин			0,25		0,49
стрихнин			0.25		0,49
Этапиразин			0.51		1,00 |
Антипирин			0,54		1,06
Кофеин			0,56		1,10
Хлозепид			0,63		1.25
Дипразин			0,66		1,30
Производные ПАБК			0,70		1,37
Тиоридазин			0,72		1,41
Аминазин			0,75		1,47
Нитразепам			0,77		1,51
Амидопирин			0.83		1,63
Тизерцин			0,87		1,71
Диазепам			0,95		1,87

Для фракции Б:

- 10% раствор хлорида железа (III) — производные пиразолона-5 (синие зоны, антипирин — красно-оранжевая зона), производные фенотиазина (аминазин, дипразин - розовые, тизерцин - фиолетовая, тиоридазин - зелено-голубая зоны);

- хлорная кислота концентрированная, содержащая 5% раствор нитрита натрия (97:3) — производные фенотиазина (аминазин, дипразин - розовые, тизерцин - фиолетовая, тиоридазин - зелено-голубая зоны);

- 10% раствор серной кислоты - хинин (голубая флуоресценция в УФ-свете)

- реактив Драгендорфа - вещества, содержащие третичный азот (оранжевые зоны).

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография. Высокая эффективность метода достигается за счет применения высокодисперсного сорбента, а высокая чувствительность и экспрессность — более тонкого слоя сорбента.

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография. Достоверность определения по­вышается за счет хроматографирования на колонках, обладающих различной полярностью. Комитет по судебной токсикологии предлагает использовать ко лонки с неподвижными жидкими фазами SE-3O, OV-17, OV- 225. Детектор ио­низации пламени.

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография. ВЭЖХ или жидкостная хроматография высокого давления является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, где элюент подается на колонку под большим дав­лением, что ускоряет проведение анализа. В качестве детекторов могут быть использованы: спектрофотометрический с переменной (190-700 нм) или фикси­рованной (254 нм) длинной волны, рефрактометрический, флуори-метрический, ионизации пламени, масс-спектрометрический, электрохимический и т.д. Иден­тификацию веществ проводят по параметрам удерживания и спектрам погло­щения.

Иммунохимические методы

В основе методов лежит специфическая реакция «антиген-антитело», где антигеном является определяемое вещество, чужеродное для организма. Спе­цифическим реагентом является антитело, которое вырабатывается как реакция на внедрение чужеродного вещества. При взаимодействии антигена-яда со спе­цифичным к нему реактивом-антителом образуется комплекс, который выпада­ет в осадок. Количественно оценить результаты реакции позволяют введение специальных меток. В зависимости от природы метки и способа детектирова­ния выделяют:

• радиоиммунный анализ,

• иммуноферментный (иммуноэнзимный) анализ,

• поляризационный флюороиммунный анализ,

• люминесцентный иммуноанализ.

Иммуноэнзимный метод получил наибольшее распространение. В каче­стве метки для антигенов используют ферменты - различные оксидазы, спо­собные количественно окислять специальное химическое вещество - хромо-генный субстрат - с образование окрашенных продуктов.

Иммунохимические методы анализа обладают высокой чувствительно­стью, специфичностью, экспрессностью, простотой исполнения. Реакции про­водятся непосредственно в биологических жидкостях и позволяют одновре­менно диагностировать большое число проб.

VII. Вопросы для самоконтроля

1. Какие этапы включает в себя предварительное исследование? В чём

цель предварительного исследования?

2. Какие химические реакции используются для предварительного обнаружения производных барбитуровой кислоты, пиразолона-5, фенотиазина?

3. Укажите особенности оформления пластинки в ТСХ-скрининге лекарственных и наркотических средств.

4. Объясните цель нанесения на пластинку двух стандартов и двух, порций экстракта в соответствующие зоны пластинки.

Какие стандарты-метчики используются при хроматографическом скрининге экстракта из кислой среды, из щелочной среды?

6. подвижных фаз, используемых в ТСХ-скринкнге.

7. Какие реактивы, и в какой последовательности применяют для обнаружения средств кислотного характера, обнаружения средств основного характера?

8. Что представляет собой реактив Драгендорфа? В чём суть и цель модификации реактива Драгендорфа?

9. Объясните термин «аналитический скрининг».

10. Какие требования предъявляются к скрининговым методам?