Заняття 2 Тема: Властивості білків
Мета заняття: вивчити реакцій зворотного і незворотного осадження білків, їх фізико-хімічні властивості, визначити ізоелектричну крапку білка.
ХIд роботи
Практичне значення роботи: осадження білків методом висалювання використовують для розділу білкових фракцій при одержанні очищених білків (наприклад, гормональних), для розділу альбумінів і глобулінів і визначення їх співвідношення в сироватці крові. Процес денатурації білків використовується для осадження білків в біологічному матеріалі з подальшим визначенням у ньому небілкових і низькомолекулярних речовин; для виявлення присутності білку і його кількісного визначення. Знаючи ізоелектричну крапку індивідуальних білків, можна підібрати максимальні умови для осадження їх із біологічних рідин, що містять суміш різних білків.
Матеріали і реактиви: штатив для пробірок, пробірки, пробіркотримач, скляні палички, піпетки, сухе пальне, сірники; дистильована вода, 1%-ий розчин яєчного білка, 10%-ий розчин натрій гідроксиду, 1%-ий розчину купрум сульфату, розчин нінгідрину, нітратна кислота, волосся або шматочок нігтя, розчин ацетату плюмбуму, розчин натрій нітриту, концентрована оцтова кислота.
Нерозведений яєчний білок, розчин сульфату амонію, хлоридна кислота; 1%-ий розчин желатину; 0,1 М і 1 М розчини оцтової кислоти, 0,1 М розчин натрій ацетату, 96 %-ий етиловий спирт (або 95 %-ий ацетон).
Дослід 1. Зворотне осадження білків − висалювання.
Принцип методу. Висалювання (зворотна реакція) − осадження білків із розчинів за допомогою великих концентрацій солей лужних і лужноземельних металів: Na2SO4, NaCl, MgSO4, а також (NH4)2SO4. При їх додаванні до розчину білка відбувається дегідратація білкових часток, і білки випадають в осад. При додаванні води до цього розчину гідратаційна оболонка білкових часток відновлюється, і осад розчиняється.
Хід роботи. У пробірку наливають 1 мл нерозведеного яєчного білка, додають такий же об’єм розчину сульфату амонію. Рідину збовтують і спостерігають невеличке помутніння. Доливають 1 мл води − помутніння зникає.
Дослід 2. Незворотне осадження білків − денатурація.
Принцип методу. Денатурація білка − це порушення структури білка і втрата ним біологічних властивостей. Осаджуються білки солями важких металів, мінеральними й органічними кислотами, кип'ятінням.
При незворотному осадженні порушується гідратаційна оболонка і заряд білка. При подальшому додаванні води осаджений білок не переходить у розчин.
Хід роботи.
а) осадження білків солями важких металів. У пробірки наливають по 1 мл нерозведеного білка, в одну додають декілька крапель розчину плюмбум ацетату, у другу − розчину купрум сульфату;
б) осадження білків мінеральними кислотами. У дві пробірки наливають по 1 мл кислот: у першу − нітратну кислоту, у другу − хлоридну кислоту. Потім у кожну обережно по стінці доливають рівний об’єм розчину білка;
в) осадження білків при нагріванні. У пробірку наливають 1 мл нерозведенного білка і кип'ятять.
Незворотність осадження в пунктах досліду 2 установлюють додаванням 0,5-1,0 мл води.
Результати дослідів заносять у таблицю:
№ з/п |
Розчин, який досліджують |
Осаджувач |
Утворення осаду |
Що відбувається після додавання води |
Висновок |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
|
|
|
|
|
Дослід 3. Визначення ізоелектричної крапки білка.
Принцип методу. Визначення ізоелектричної крапки білків засновано на спроможності білків під дією осаджувачів, що викликають дегідратацію білків, при значенні рН середовища, що відповідає їх ізоелектричній крапці, легко осаджуватися.
Хід роботи. У 6 пробірок поміщають відповідну кількість (мл) розчинів оцтової кислоти, ацетату натрію, дистильованої води і желатину (таблиця). Вміст кожної пробірки перемішують. Потім у всі пробірки повільно по стінці доливають по 2 мл спирту. Через 30 хв. визначають ізоелектричну крапку. Вона буде відповідати рН пробірки з максимальним ступенем помутніння.
№ про-бірки |
Вода |
СН3СООН (0,1 моль/л) |
СН3СООН (1 моль/л) |
СН3СООNа (0,1 моль/л) |
Розчин желатину (1%-ий) |
рН сере-довища |
Зміни, що спостері- гаються* |
1 |
3,8 |
0,2 |
– |
2,0 |
2,0 |
5,6 |
|
2 |
3,5 |
0,5 |
– |
2,0 |
2,0 |
5,3 |
|
3 |
3,2 |
– |
0,8 |
2,0 |
2,0 |
5,0 |
|
4 |
3,0 |
1,0 |
– |
2,0 |
2,0 |
4,7 |
|
5 |
2,0 |
2,0 |
– |
2,0 |
2,0 |
4,4 |
|
6 |
– |
4,0 |
– |
2,0 |
2,0 |
4,1 |
|
Примітка. * − Відзначати: “−” – відсутність помутніння; “+” – поява помутніння; “++” – середнє помутніння; “+++” − значне помутніння.
В кінці лабораторної роботи зробити загальний висновок.
Заняття 3
Тема: Кількісне визначення білків
за допомогою біуретового реактиву
Мета заняття: вивчити методику кількісного визначення білків.
ХІД РОБОТИ
Практичне значення роботи: Кількісні методи визначення білків використовуються при встановленні, наприклад, діагнозу багатьох захворювань шляхом проведення визначення концентрації білків у біологічних рідинах. Підвищення рівня концентрації білка до 120 г/л (гіперпротеїнемія) зустрічається рідко (наприклад, при деяких хронічних запальних процесах внаслідок утворення антитіл − поліартрит, ревматизм; при згущенні крові через значні втрати рідини). Зниження кількості білка (гіпопротеїнемія) спостерігається при недостатньому надходженні білків з їжею, при порушенні процесів біосинтезу білків в органах, при ураженні печінки.
Матеріали і реактиви. Робочий розчин біуретового реактиву, стандартний розчин альбуміну (1 мл стандартного розчину містить 0,1 г білка), фотоелектроколориметр, пробірки, піпетки, кювети з товщиною прошарку 1 см, міліметровий папір.
Принцип методу. Білки (поліпептиди) у лужному розчині в присутні купрум (ІІ) сульфату утворюють комплексні сполуки міді, пофарбовані в синьо-фіолетовий колір, інтенсивність якого залежить від кількості пептидних зв'язків у молекулі білка. Продукти неповного гідролізу білка (пептиду) дають червоне або рожеве забарвлення в біуретовій реакції.
Спочатку пептидні групи поліпептиду зазнають у лужному середовищі єнолізацію:
Єнольна форма поліпептиду взаємодіє з купрум (ІІ) гідроксидом й утворює пофарбований у синьо-фіолетовий колір комплекс:
Хід роботи. До 5 мл робочого розчину біуретового реактиву додають, уникаючи утворення піни, 0,1 мл сироватки крові. Через 30 хв., саме пізніше через годину, пробу колориметрують на ФЕК в кюветі із шириною прошарку 10 мм при зеленому світлофільтрі (із максимумом пропускання 540-560 нм, краще 546 нм). Показники екстинції враховують у порівнянні з такими контрольної проби, що готують шляхом доливання до 5 мл робочого розчину біуретового реактиву 0,1 мл розчину натрій хлориду. Розрахунки ведуть за калібрувальною кривою.
Для побудови каліброваного графіка в п'ять хімічних пробірок поміщають відповідно 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мл розчину альбуміну, що містить 10 мг білка в 1 мл. Загальний об’єм у кожній пробірці доводять до 1 мл дистильованою водою і потім додають по 5 мл біуретового реактиву. Вміст пробірок перемішують і лишають на 30 хвилин, потім знімають показники екстинції.
Після виміру отримані дані відкладають: на осі ординат величину оптичної щільності, а по осі абсцис − кількість білку, що відповідає цій величині. Потім визначають кількість білка в сироватці крові, також як і при одержанні каліброваної кривої. Концентрацію білка розраховують на 1 мл не розведеної сироватки.
В кінці лабораторної роботи зробити загальний висновок.