Общие правила определения активности ферментов

О количестве фермента можно судить только косвенно по его активности, т. е. по производимому ферментом действию. Присутствие и количество фермента распознается по специфичности и скорости катализируемой им реакции.

Методы определения активности фермента:

• по скорости накопления продуктов ферментативной реакции

• по скорости убыли субстрата

Рекомендуется активность ферментов определять по начальной скорости реакции, когда количество превращенного субстрата не превышает 20% от исходного.

Основные условия при определении активности ферментов

• Буферный раствор должен поддерживать рН инкубационной смеси, близкой к оптимальному для данного фермента. Результаты определения активности фермента, полученные с помощью одного и того же метода, но с разными буферными растворами, хотя одного и того же рН, несравнимы.

• Температура в пределах 25—40°С, как правило 37°С.

• При необходимости длительной инкубации к реакционной смеси добавить антисептики (толуол, хлороформ, тимол и др.), при этом не влияющие на активность определяемого фермента.

• Поддерживать оптимальный состав реакционной смеси (присутствие коферментов, ионов металлов и др.).

Методы определения активности ферментов

В КДЛ наиболее часто - колориметрические и спектрофотометрические методы.

Колориметрические методы - измерение (ФЭК) интенсивности окраски вещества, образующегося при взаимодействии субстрата или продукта действия фермента со специфическими реактивами, добавленными в пробу, как правило, после остановки ферментативной реакции.

Спектрофотометрические методы – основаны на изменении светопоглощения в ультрафиолетовом спектре при переходе вещества из окисленной формы в восстановленную. Определение активности ферментов, основанное на разнице спектров поглощения окисленной и восстановленной форм НАД и НАДФ, получило название оптического теста Варбурга.

Требования к материалу при определении ферментов

• Кровь натощак или не ранее, чем через 4 ч. после приема пищи.

• Только негемолизированная сыворотка

• Быстро отделять сыворотку от сгустка крови (не позже 2 ч. с момента взятия крови).

• Хранение сыворотки при комнатной температуре для большинства ферментов не более 6—8 ч., при 4°С — около одной недели, а в замороженном состоянии — в течение одного месяца. Исключение: ЛДГ (активность в течение первых трех дней лучше сохраняется при комнатной температуре)

• Избегать повторных замораживаний и оттаиваний → денатурация белка, потеря ферментативной активности.

Требования к материалу при определении ферментов (продолжение)

• Если определение проводится в замороженной сыворотке, оттаивание сыворотки должно производиться на водяной бане при температуре 37°С.

• Сыворотка лучше, чем плазма. Если в качестве материала используется плазма - учитывать, что многие антикоагулянты могут ингибировать ферментативную активность. ЛДГ и амилаза теряет активность в "оксалатной" плазме, альдолазы – при использовании фторидов, . Фториды нельзя использовать при определении альдолазной активности. Оксалат и цитрат ингибируют амилазную активность и т.д.

• Интерференция лекарств - салицилаты повышают активность аминотрансфераз, сульфаниламиды подавляют активность карбоангидразы, препараты опия могут увеличивать активность амилазы и т.д.