Пдрф-анализ продуктов амплификации

Исследованный полиморфный локус является рестрикционным, т.е. данный полиморфизм выражается в наличи фрагмента ограничения Taq1A полиморфизма (RFLP) (rs1800497 dbSNP; g.32806C>T в GenBank AF050737.1), это связано с уменьшением плотности рецептора D2, хотя это везде не принято (Neville et al., 2004).

Поэтому после проведения реакции амплификации ПЦР-продукты подвергали последующей рестрикции, для чего их обрабатывали рестрикционной смесью, состоящей из 1 мкл буфера и 0,1 мкл рестриктазы TaqIA (на 10 мкл ПЦР-продукта) и инкубировали 12 часов при 65°.

Применение электрофореза для анализа полиморфизма днк

После окончания ПЦР, специфичность амплификации, количество амплификата проверяли с помощью электрофореза. Перед началом электрофореза гель в течении 30 минут выдерживали при напряжении 4 В/см для того, чтобы очистить его от молекулярных примесей. Напряжение для разгонки образцов устанавливали из расчета 8 В/см.

Образцы ДНК перед нанесением в гель смешивали с буфер-краской, Буфер-краска имеет в составе 0,25 % бромфенолового синего; 0,25 ксиленцианола; 30% глицерина. Электрофорез ДНК проводили в вертикальном блоке полиакриламидного геля, в трис-боратном буфере (0,089 м трис-бората, 0,089М борной кислоты, 0,002М ЭДТА) при напряжении электрического и В/см в течении 1,6-1,7 часов.

После проведения электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидия (50 мкг/л) в течении 10 – 15 минут и визуально в ультрафиолетовом свете оценивали качество электрофореза (Маниатис, Фрич, Сэмбрук, 1984). Пример такого электрофореза можно увидеть на рисунке 1.

Рис.1. Электрофореграмма, демострирующая продукты ПЦР

полиморфного локуса TaqIА в гене DRD2.

Рис 2. Электрофореграмма,демострирующая генотипы полиморфного локуса TaqIА в гене DRD2

На данном фотоснимке видны отдельные генотипы, представленные характерными полосами следующего молекулярного веса: *A1/*A1 – 310 пар оснований; *A1/*A2 –310, 180 и 130 пар оснований; *A2/*A2 –180 и 130 пар оснований.

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ “Statistica for Windows 5.0” (StatSoft), программного обеспечения MS Excel 98 (Microsoft) и компьютерных программ “GENEPOP” и “RxC” (Rows x Columns) (Roff, Bentzen, 1989).

Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга использовали модифицированный критерий ²(Р), определяемый с помощью программы RxC по алгоритму, описанному D.Roff и P. Bentzen (Roff, Bentzen, 1989).

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Анализ ассоциаций полиморфного локуса TaqIа в гене drd2 с уровнем интеллектуального развития (iq)

При типировании полиморфного локуса TaqI A в гене DRD2 выявлено два аллеля – *A1, *A2 и три генотипа *A2/*A2 (наличие мутации в гомозиготном состоянии), *A1/*A2 (гетерозиготы), *A1/*A1 (отсутствие мутации в гомозиготном состоянии). Аллель А1 оставался интактным после обработки рестриктазой, а аллель А2, несущий мутационное изменение, подвергался ферментативному гидролизу с образованием двух фрагментов длиной 130 и 180 пар оснований. Было показано, что наличие аллеля *А1, не имеющего сайта узнавания к рестриктазе TaqI A, связано с уменьшением плотности рецептора D2 (Neville et al., 2004).

Исследованная выборка (101 индивид) была разделена на две группы в соответствии с уровнем интеллектуального развития: нормальный уровень интеллектуального развития (90-110 баллов) и высокий уровень интеллектуального развития (выше 110 баллов). В группе с нормальным уровнем интеллектуального развития установлено следующее распределение частот генотипов: 1)DRD2*A1/*A1 – 15,38%; 2)DRD2*A1/*A2 – 23,08%; 3)DRD2*A2/*A2 – 61,54%. Частота аллелей в данной группе составила 26,92%(DRD2*A1) и 73,08% (DRD2*A2). У лиц с высоким уровнем интеллектуального развития генотип DRD2*A1/*A1 встречается с частотой 8,82%, DRD2*A1/*A2 – 30,88% и DRD2*A2/*A2 – 60,3%. Частота аллеля DRD2*A1 составляет 24,26% и DRD2*A2 – 75,74% соответственно. Данные представлены в таблице 1.

При попарном сравнении частот генотипов и аллелей полиморфного локуса TaqIА гена DRD2 между двумя исследованными группами не показано статистически значимых различий.

Таблица 1

Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса TaqI A гена DRD2 в группе лиц с различным уровнем интеллектуального развития

Генотип/аллели	Высокий уровень IQ (выше 110 баллов)		Нормальный уровень IQ (90-110 баллов)		χ²,p
	N	P±m, %	N	P±m, %
A1A1	6	8,82±3,44	4	15,38±7,1	χ²=0,3018, p=0,5831
A1A2	23	30,88±5,6	8	23,08±8,26	χ²=0,2438, p=0,6218
A2A2	42	60,3±5,93	18	61,54±9,54	χ²=0,0005, p=1,0005
n	71		30
A1*	33	24,26±3,68	14	26,92±6,15	χ²=0,0359, p=0,8514
A2*	103	75,74±3,68	38	73,08±6,15	χ²=0,0359, p=0,8514

В исследованной нами выборке (201 индивидов) в группе спортсменов установлено следующее распределение частот генотипов: 1)DRD2*A1/*A1 –5%; 2)DRD2*A1/*A2 –30%; 3)DRD2*A2/*A2 – 65%. Частота аллелей в данной группе составила 20%(DRD2*A1) и 80% (DRD2*A2). У лиц, не занимающихся спортом, генотип DRD2*A1/*A1 встречается с частотой 10,74%, DRD2*A1/*A2 –29,75% и DRD2*A2/*A2 –59,51%. Частота аллеля DRD2*A1 составляет 25,62%, DRD2*A2 –74,38%. Данные представлены в таблице 2.

При попарном сравнении частот генотипов и аллелей полиморфного локуса TaqIА гена DRD2 между двумя исследованными группами не показано статистически значимых различий.

Из результатов статистического анализа следует, что аллель *A1, не несущий мутантного изменения, встречается несколько реже (26,92% и 25,62%), по сравнению с мутантным аллелем *A2 (75,74% и 74,38%). Что нам это дает?

									Таблица 2.
Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного локуса TaqI A гена DRD2 в группе лиц с различным уровнем спортивной подготовки
Генотип/аллели	Спортсмены				Не спортсмены			χ²,p
	N	P±m, %			N	P±m, %
A1A1	4	5±2,44			13	10,74±2,82		χ²=1,3778, p=0,2414
A1A2	24	30±5,12			36	29,75±4,16		χ²=0,0005, p=1,0005
A2A2	52	65±5,33			72	59,51±4,46		χ ²=0,4054, p=0,5247
n	80				121
A1*	32	20±3,16			62	25,62±2,81		χ²=1,3992, p=0,2378
A2*	128	80±3,16			180	74,38±2,81

Необходимо дальнейшее исследование в данном направлении.

ВЫВОДЫ

1. Проведен обзор научной литературы по теме исследования.

2. Освоены основные методы молекулярно-генетического анализа.

3. Подобраны оптимальные условия для проведения ПЦР и ПДРФ анализа полиморфного локуса TaqIA в гене рецептора дофамина (DRD2).

4. Проведено типирование групп индивидов из Республики Башкортостан по полиморфному локусу TaqIA в гене D2-рецептора дофамина (DRD2).

5. Проведен анализ ассоциаций полиморфного локуса TaqIА в гене DRD2 с разным уровнем интеллектуального развития и спортивной подготовки.

6. Выявлена более высокая частота аллеля *A2 (75,74% и 74,38%)*, имеющего мутации, по отношению к аллелю *A1 (75,74% и 74,38%), не несущего мутантное изменение в исследованных группах.