Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы исследования

В работе использованы образцы ДНК индивидов возрасте 18-35 лет, проживающих в Республике Башкортостан. Образцы ДНК получены после медицинского осмотра с письменного согласия испытуемых при содействии Башкирского государственного педагогического университета им.М.Акмуллы.

2.2. Методы исследования Определение уровня интеллектуального развития (iq) с помощью теста Кеттелля

В исследовании для определения IQ использовался тест, предложенный Р. Кеттеллом в 1958 году, который измеряет способность быстрого решения несложных задач, не требующих предварительной подготовки (Денисов, Доровеев, 1994). Этот тест имеет определение «культурно-свободный», так как предназначен для определения уровня интеллектуального развития лиц, не знакомых даже с азбукой, независимо от влияния таких факторов, как культурный уровень, образование и т.п. Этот тест в целом ориентирован на конвергентный тип мышления, направленный на поиск единственного решения. Тест состоит из двух больших частей, построенных аналогичным образом.

По Кеттеллу считается, что средняя норма IQ находится в пределах от 90 до 110 баллов (Денисов, Доровеев, 1994). Показатели выше этого уровня могут свидетельствовать о высоких способностях испытуемого, ниже него – об отставании в умственном развитии.

Выделение днк методом фенольно-хлороформной экстракции

Выделяли ДНК из периферической крови человека методом фенольно-хлороформной реакции (Mathew, 1984). Для этого разрушали плазматическую и ядерную мембраны лейкоцитов и освобождали ДНК от клеточных белков.

Необходимые растворы:

0.2 МgСl₂ - 1,9г МgС1₂ доводили Н₂О до 100 мл. Удельный вес должен быть 1,015.

Трис НС1 2М рН 7,6 (для лизирующего буфера) - Трис 60,55г+150 мл

Н₂O мешали на магнитной мешалке. Постепенно добавляли примерно 30 мл НС1, доводя рН до 7,6. доводили обьем с помощью дист. Н₂О до 250 мл.

Лизирующий буфер: сахароза-109,44г; Трис НС1 (2М, рН 7,6) - 5мл; МgС1₂-25мл (0,2М); Трилон + 100-10 мл. Доводили обьем дист. Водой до 1 л, перемешивали.

NаС1 5М: NаС1 - 29,22г 80мл Н₂О, растворяли на магнитной мешалке.

Доводили обьем дист. Водой до 1000 мл.

ЭДТА 0,5М рН 8,0 : 186,1 г двузамещенной соли ЭДТА . 2Н₂О+800мл Н₂О,

интенсивно перемешивали на магнитной мешалке. Доводили рН до 8,0 (~20г NаОН), объем диет. водой до 1л.

ЭДТА (saline): ЭДТА 0,5М, рН 8,0-25 мл ; NаС1 5М - 7,12 мл. доводили объем дист. водой до 500 мл.

10% SDS (додецилсулъфат Nа): 25г чистого SDS+ 200 мл Н₂О перемешивали на магнитной мешалке при 68°С. Доводили рН до 7,2; объем диет. Водой до250 мл.

Протеиназа К - растворяли лиофилизированную протеиназу К в стерильной дист. воде в концентрации 10 мг\мл , хранили при -20°С.

Насыщенный буфером фенол - в большинстве случаев фенол высокой

степени чистоты можно использовать без дополнительной перегонки.

Расплавляли фенол при 65°С в присутствии равного объема 0,5М трис-HС1, рН 8,0, содержащего 0,2 % 8-гидроксихинолин и 0,2% 2- меркаптоэтанол (2-МЭ). Когда фенол полностью расплавлялся, тщательно перемешивали смесь, отбирали водную фазу и дважды экстрагировали фенол 0,1М трис НС1, рН 8,0, содержащим 0,2% 2-МЭ. После последней экстракции водную фазу не удаляли, а оставляли ее в сосуде с фенолом. В таком виде насыщенный фенол хранили при 4°С до 1 месяца.

Первый этап:

1. К 10 мл. крови (если есть сгустки, то их тщательно разбивали) добавляли 50 мл. лизирующего буфера и перемешивали. Переносили кровь в центрефужную полипропиленовую пробирку.

2.Уравновешивали пробирки лизирующим буфером.

3.Осаждали лейкоциты центрифугированием при 4000 об\мин 20 минут при 4°С (на центрифуге К-23Д).

4.Сливали недостаточную жидкость, на дне немного с боку оставалось небольшое розоватое пятно кольцо.

5. Осадок с помощью стеклянной палочки соскребали со стенок, добавили 8мл ЭДТА saline, суспендировали и переливали в стеклянный стакан.

6.Добавляли 50 мл протеиназы К(10 мг\мл) плавно перемешивали.

8.Закрывали крышкой и инкубировали при 42°С 16 часов.

Второй этап:

1. К инкубированной смеси добавляли 0,5 мл 5М перхлората натрия (NаС1Oз) и 8мл фенола, насыщенного 1М трис-НСl до рН 7,8, перемешивали.

2.Центрифугировали при 4000 об\мин в течении 10 минут (на центрифуге К-23Д).

3.Тщательно отбирали верхнюю (водную) фазу с помощью пипетки в чистую пробирку.

4. Добавляли к верхней фазе 4 мл доведенного фенола и 4 мл хлороформа. Перемешивали очень аккуратно.

5.Разделяли водную и органическую фазы центрифугированием при 4000 об\мин в течении 10 минут (на центрифуге К-23Д).

6.Тщательно отбирали, стараясь не перемешать, верхнюю вязкую водную фазу, содержащую ДНК.

7.Добавляли к фазе, содержащей ДНК, 8 мл хлороформа.

8.Центрифугировали при 4000 об\мин в течении 10 минут.

9.Очень осторожно отбирали верхнюю фазу, содержащую очищенную от белков ДНК, в коническую колбу.

10. Добавлял и к отобранной верхней фазе три объема холодного этанола.

11 .Тщательно и осторожно перемешивали в одном направлении до образования супернатанта (осадка ДНК).

12.Этанол сливали, отбирали супернатант и промывали ДНК два раза

небольшим количеством 70 % этанола.

13.Чистый осадок ДНК с небольшим количеством этанола переливали в эпендорф и ставили в холодильник для хранения.

Перед началом исследования ДНК растворяли в деионизированной воде.