2.3.Молекулярно-генетические методы

Молекулярно-генетическая часть работы выполнена в центре молекулярно-генетических и инновационных исследований при кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета им. М.Акмуллы.

2.3.1.Выделение геномной днк

ДНК была выделена из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта использовали раствор ацетата натрия. При заборе крови к 2 мл консерванта добавляли 8 мл крови и хорошо перемешивали.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса использовали метод выделения ДНК из крови, описанный Мэтью (Mathew, 1984):

1. Кровь в пробирке тщательно перемешивали и переливали в 100 мл центрифужный стакан, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5мМ MgCl₂, 10 мМ трисHCl, pH 7,6.

2. Смесь центрифугировали 20 мин. при 4000 об./мин.

3. Надосадочную жидкость сливали, а к получившемуся осадку приливали 8 мл 25 мМ ЭДТА, pH 8,0. Содержимое пробирки суспензировали.

4. К суспензии добавляли 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляли на ночь в термостате при температуре 42С.

Экстракцию ДНК осуществляли в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляли 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М Tris-HCl до pH 7,8.

2. Смесь центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 мин.

3. Отбирали водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывали смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждали двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяли в 1,5 мл дистиллированной H₂O; раствор хранили при -20С.

2.3.2. Полимеразная цепная реакция

Амплификацию изученных локусов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на амплификаторе “Терцик” с использованием ДНК-полимеразы Termus aquaticus.

При типировании по полиморфным маркерам генов HTR2A, SLC6А4 условия ПЦР были следующими. Использовали реакционную смесь объемом 10 мкл, которая содержала 1 мкл буфера (670 мМ трис-HCl, рН=8.6, 166 мМ (NH₄)₂SO₄, 25 мМ MgCl₂, 0.01% Тритон Х-100), смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 200 мМ каждого), 10-30 нг геномной ДНК, по 10 пмоль каждого праймера, 1ед. Taq-полимеразы. Последовательности праймеров приведены в табл.2.

Для выявления полиморфизма в рестрикционном локусе 5HT 2A10 мкл реакционной смеси обрабатывали 1 единицей рестриктазы и выдерживали в течение 12 часов при 37⁰С.

Для проведения амплификации использовали программы, приведенные для амплификатора типа МС2, запрограммированного на объем 10, или 15 мкл в режиме активного, быстрого (“fast”) регулирования (табл.2).

Таблица 1

Тип полиморфизма и номенклатура аллелей анализируемых ДНК-локусов.

Ген, хромосомная локализация	Белковый продукт	Полиморфизм (локализация), аллели (размер фрагментов, п.о.)	Физиологическая характеристика
SLC6A4 17 q11.1 – 12, состоит из 14 экзонов и занимает около 35 kb геномной ДНК	Переносчик серотонина, регулирует уровень серотонина в сыворотке	5-HTTLPR Инсерционноделеционный полиморфизм в промоторной области гена (на 1 kb выше первого экзона) определяет транскрипционную активность гена SLC6A4* L (528) SLC6A4* S (484)	Обуславливает снижение экспрессии гена, повышение уровня серотонина в тканях.
5HT2A 13q14-21, состоит из 3 экзонов и 2 интронов, 20 т.п.о	Рецептор серотонина	А1438G (промоторная область) 5HT2A*A (468) 5HT2A*G (224+244)	Обеспечивает усиленную рецепцию серотонина в синапсе

Таблица 2