Вопрос40. Иммуноиндикация в диагностике инфекционных заболеваний

Для диагностики вирусных инфекций широкое применение нашли методы иммунодиагностики (серодиагностики и иммуноиндикации). Они реализуются в самых разнообразных реакциях иммунитета:

• радиоизотопный иммунный анализ (РИА),

• иммуноферментный анализ (ИФА),

• реакция иммунофлюоресценции (РИФ),

• реакция связывания комплемента (РСК),

• реакция пассивной гемагглютинации (РПГА),

• реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и другие.

Вопрос 41. Плазмиды бактерий и их значение. Использование плазмид в генной инженерии

Значение плазмид для медицины состоит в том, что они контролируют синтез различных факторов патогенности у многих видов бактерий, в том числе у возбудителей чумы, сибирской язвы, иерсиниозов, дизентерии, эшерихиозов и др. Не вызывает сомнения, что возникновение диареегенных кишечных палочек (энтеротоксигенных, энтеропатогенных, энтероинвазивных и др.) является следствием приобретения ими плазмид, которые наделяют их факторами адгезии, инвазии и способностью синтезировать термолабильные и термостабильные энтеротоксины. Наличие в природе таких плазмид (особенно с широким кругом хозяев) может стать причиной образования новых вариантов патогенных бактерий.

Не менее важную роль играют R-плазмиды. В условиях широкого применения антибиотиков и других химиопрепаратов происходит естественный отбор тех штаммов патогенных бактерий, которые являются носителями R-плазмид. Среди них формируются новые эпидемические клоны патогенных бактерий. В настоящее время они играют ведущую роль в эпидемиологии инфекционных болезней, и от их распространения во многом зависит эффективность антибиотико- и химиотерапии, а в итоге — здоровье и жизнь людей.

Общебиологическое значение плазмид заключается в том, что они выполняют по крайней мере три важнейшие функции для бактерий, обеспечивая одновременно существование как бактерий, так и собственное. Во-первых, они контролируют у бактерий обмен генетическим материалом. Во-вторых, контролируя синтез факторов патогенности, они обусловливают благоприятные возможности для размножения патогенных бактерий в естественных для них условиях (в организме животного и человека), а следовательно, для сохранения этих видов в природе. В-третьих, плазмиды являются уникальным биологическим средством самозащиты бактерий, так как они обеспечивают их приобретенным и наследуемым специфическим иммунитетом против различных химических (лекарственных и иных веществ) и других агентов.

Плазмиды широко используются в генной инженерии для переноса генетической информации и генетических манипуляций. Для этого создаются искусственные плазмиды — векторы, состоящие из частей, взятых из разных генетических источников, а также из искусственно созданных фрагментов ДНК.

Вопрос43 Дыхание бактерий. Типы дыхания бактерий. Методы культивирования анаэробов

Дыхание является самой совершенной формой окислительного процесса и наиболее эффективным способом получения энергии. Главное преимущество дыхания состоит в том, что энергия окисляемого вещества — субстрата, на котором микроорганизм растет, используется наиболее полно. Поэтому в процессе дыхания перерабатывается гораздо меньше субстрата для получения определенного количества энергии, чем, например, при брожениях.

По типу дыхания все микроорганизмы разделяются на облигатные (строгие) аэробы, облигатные анаэробы и факультативные (необязательные) анаэробы.

Облигатные аэробы (микобактерии туберкулеза и др.) живут и развиваются при свободном доступе кислорода, т. е. реакции окисления осуществляются у них при участии молекулярного кислорода с высвобождением большого количества

Облигатные анаэробы (клостридии столбняка, ботулизма и др.) способны жить и размножаться только в отсутствие свободного кислорода воздуха. Дыхание у анаэробов происходит путем ферментации субстрата с Образованием небольшого количества энергии.

Факультативные анаэробы могут размножаться как при наличии молекулярного кислорода, так и при отсутствии его. К ним относят большинство патогенных и сапрофитных бактерий. Процессы разложения органических веществ в бескислородных условиях, сопровождающиеся выделением энергии, называют также брожением

Механические методы:

1. Посев уколом в столбик сахарного агара.

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пас­теровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.

3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиоло­гическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Со­держимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают ана­эробы

Физические методы:

1. Анаэростат — создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипя­тят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного мас­ла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,

Химические методы

1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пиро­галлол.

2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.

Биологический метод Фортнера

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну полови­ну засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растоп­ленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, ко­гда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы

Вопрос44 Понятие о метаболизме. Анаболизм и катаболизм. Особенности метаболизма у бактерий и методы его изучения. Ферменты бактерий. Использование ферментативной активности бактерий при их идентификации.

МЕТАБОЛИЗМ - это обмен веществ, химические превращения, протекающие от

момента поступления питательных веществ в живой организм до момента, когда конечные продукты этих превращений выделяются во внешнюю среду.

Основными метаболическими процессами являются анаболизм (ассимиляция) и катаболизм (диссимиляция).

Анаболизм, или ассимиляция (от лат. assimilatio — уподобление), представляет собой эндотермический процесс уподобления поступающих в клетку веществ веществам самой клетки. Она является «созидательным» метаболизмом.

Важнейшим моментом ассимиляции является синтез белков и нуклеиновых кислот. Частным случаем анаболизма является фотосинтез, который представляет собой биологический процесс, при котором органическое вещество синтезируется из воды, двуокиси углерода и неорганических солей под влиянием лучистой энергии Солнца. Фотосинтез в зеленых растениях является автотрофным типом обмена.

Катаболизм, или диссимиляция (от лат. dissimilis — расподобление), является экзотермическим процессом, при котором происходит распад веществ с освобождением энергии. Этот распад происходит в результате переваривания и дыхания. Переваривание представляет собой процесс распада крупных молекул на более мелкие молекулы, тогда как дыхание является процессом окислительного катаболизма простых Сахаров, глицерина, жирных кислот и дезаминированных аминокислот, в результате которого происходит освобождение жизненно необходимой химической энергии. Эта энергия используется для пополнения запасов аденозинтри-фосфата (АТФ), который является непосредственным донором (источником) клеточной энергии, универсальной энергетической «валютой» в биологических системах.

Метаболизм (обмен веществ) бактерий представляет собой совокупность двух взаимосвязанных противоположных процессов катаболизма и анаболизма

Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что:

• его интенсивность имеет достаточно высокий уровень, что возможно обусловлено гораздо большим соотношением поверхности к единице массы, чем у многоклеточных;

• процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;

• субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк - от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений, включая антропогенные вещества - загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее самоочищения);

• бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов - это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов и широте субстратного спектра.

Изучают метаболизм бактерий с помощью физико-химических и биохимических методов исследования в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих то или иное соединение в качестве субстрата для трансформации. Такой подход позволяет судить об обмене веществ путем более детального изучения процессов различных видов обмена (белков, углеводо

Ферменты распознают соответствующие метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции. Являются белками, участвуют в процессах анаболизма (синтеза) и катабо лизма (распада), то есть метаболизма. Многие ферменты взаимосвязаны со структурами микробной клетки. Например, в цитоплазматической мембране имеются окислительно-восстановительные ферменты, участвующие в дыхании и делении клетки. Окислительно-восстановительные ферменты цитоплазматической мембраны и ее производных обеспечивают энергией интенсивные процессы биосинтеза различных структур, в том числе клеточной стенки.

Определение ферментативной активности бактерий играет огромную роль в их идентификации. Например, все аэробы или факультативные анаэробы обладают супероксид дисмутазой и каталазой — ферментами, защищающими клетку от токсичных продуктов кислородного метаболизма. Практически все облигатные анаэробы не синтезируют эти ферменты. Только одна группа аэробных бактерий — молочнокислые бактерии каталазонегативны, но аккумулируют пероксидазу — фермент, катализирующий окисление органических соединений под действием Н202 (восстанавливается до воды). Наличие аргининдигидролазы — диагностический признак, позволяющий различить сапрофитические виды Pseudomonas от фитопатогенных. Среди пяти основных групп семейства Enterobacteriaceae только две — Escherichiae и Erwiniae— не синтезируют уреазу. Часто вирулентность штамма связана с повышенной активностью ферментов, ответственных за синтез токсинов