Ход работы

1. В первые 3 пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 5, 10 и 15 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения ка­либровочной кривой. В четвертую пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую нужно опре­делить.

2. В каждую пробирку добавляют по 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для раз­вития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с толщиной слоя 1 см, пользуясь зе­леным светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе исполь­зуют биуретовый реактив.

3. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат - соответствующие – значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.

Записывают принцип метода; зарисовывают калибро­вочный график зависимости оптической плотности от концентрации стандартного раствора белка. Пользуясь этим графиком, рассчитывают содержание белка в испы­туемом растворе и записывают результат.

Тема 3 ферменты

(4 ч)

Работа 7 Ферменты как биологические катализаторы

Ферменты, энзимы – специфические белки всех живых клеток, играющие роль биологических катализаторов. С их помощью осуществляется обмен веществ и энергии в организмах.

Свойства ферментов:

1. Все ферменты белковой природы (простые и слож­ные).

2. Все ферменты характеризуются термолабильностью, т.е. оптимум дей­ствия 0- 45 °С.

3. Ферменты специфичны; различают абсолютную и от­носительную специфичность.

4. Ферменты действуют в мягких условиях среды, с определенным значением рН.

5. Ферменты обладают высокой каталитической актив­ностью (например, холинэстераза за 1 с расщепля­ет 300 000 молекул ацетилхолина).

Исследуемый материал: раствор слюны.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 15 шт., стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1 % раствор крахмала; 2) 10 % раствор NaOH; 3) 1 % раствор CuSO₄; 4) фосфатный буфер; 5) 1 % раствор NaCl; 6) водный раствор I₂ в КI.

Ход работы

Для исследования активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта ополаскивают водой) и доводят до метки 10 мл.

Опыт 1. Определение термолабильности амилазы слюны.

Таблица 4

Реагенты, условия опытов	Количество реагента, капель
	Опыт А	Опыт Б	Контроль
Раствор слюны	10	-	-
Кипяченая слюна (кипятить 2 мл раствора слюны 5-8 мин, охладить)	-	10	-
Вода	-	-	10
Крахмал	10	10	10
Термостат, 38 ºC, 10 мин
Реакция с иодом (5 капель раствора из пробирки + 1капля I2 в КI), окраска
Реакция Троммера (5 капель раствора из пробирки + 5 капель 10 % NaOH + 3 капли 1 % CuSO4, кипятить 1 мин), окраска
Вывод:

Таблица 5

Опыт 2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции.

Реагенты, условия опытов	Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4
Крахмал, мл	1	1	1	1
Раствор слюны, мл	1	1	1	1
Температура, ºC	0	20	40	100
Инкубировать 10 мин и затем добавить по 1-2 капли I2 в КI
Зарегистрировать окрашивание

Таблица 6

Опыт 3. Определение оптимума рН для действия амилазы.

Реагенты	Условия опытов
	Значение рН
	6.0	6.4	6.8	7.2	7.6	8.0
Буферный раствор, мл	2	2	2	2	2	2
Крахмал, 0,5 %, мл	1	1	1	1	1	1
Раствор слюны, мл	1	1	1	1	1	1
Термостат, 38 ºC, 10 мин
Раствор I2 в КI, капель	1	1	1	1	1	1
Окраска
Вывод:

Таблица 7

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

Реагенты, условия опытов	Количество реагента
	Проба 1	Проба 2	Контроль
Раствор слюны, мл	1	1	1
Вода, капель	-	-	2
NaCl, капель	2	-	-
CuSO4 , капель	-	2	-
Крахмал, капель	5	5	5
Экспозиция, 5 мин
Раствор I2 в КI, капель	1	1	1
Результат, окраска
Вывод:

Работа 8 Свойства ферментов

Исследуемый материал: раствор слюны, срезы клубней вареного и сырого картофеля.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1 % раствор крахмала; 2) Феллингова жидкость, 3) 1 % раствор сахарозы; 4) гваяковая настойка; 5) NaI (порошок); 6) NaCl (порошок); 7) КClO₃ (порошок); 8) фильтрат дрожжей.