Тема 1 белки

(4 ч)

Работа 1 Цветные реакции на белки и аминокислоты

Цветные реакции дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях и получить представление о его аминокислотном составе.

Биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке. Её способны дать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей.

Нингидриновая реакция характерна для α-аминогрупп. Нингидриновая реакция используется для количественного определения α-аминокислот в аминокислотных анализаторах.

Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот – триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих бензольное ядро.

Реакция Миллона открывает в белке циклическую аминокислоту тирозин. Белки, не содержащие тирозин, этой реакции не дают.

Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно.

Исследуемый материал: раствор яичного белка (способ приготовления дан в приложении).

Оборудование: градуированная пипетка объемом 1 мл, пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт., стеклянные палочки, пробиркодержатель, штатив, спиртовка.

Реактивы: 1) 10 % раствор NaOH; 2) 1 % раствор CuSO₄; 3) 0,5 % раствор нингидрина; 4) HNO₃ (конц.); 5) реактив Миллона; 6) реактив Фоля; 7) дистиллированная вода.

Ход работы

Провести цветные реакции на исследуемом растворе яичного белка. Полученные результаты оформить в виде следующей таблицы:

Таблица 1

Реагент	Количество реагента, капель
	Опыт	Контроль
1	2	3
Биуретовая реакция
Раствор белка	5	-
Вода	-	5
NaOH, 10 %	5	5
CuSO4, 1 %	2	2
Наблюдение окрашивания

Продолжение

1	2	3
Нингидриновая реакция
Раствор белка	5	-
Вода	-	5
Раствор нингидрина	5	5
Кипятить 1-2 мин
Наблюдение окрашивания
Ксантопротеиновая реакция
Раствор белка	5	-
Вода	-	5
HNO3, конц.	5	5
Кипятить до появления окраски раствора белка
Наблюдение окрашивания
Реакция Миллона
Раствор белка	5	-
Вода	-	5
Реактив Миллона	3	3
Нагреть до окрашивания осадка белка
Наблюдение окрашивания
Реакция Фоля
Раствор белка	5	-
Вода	-	5
NaOH, 30 %	5	5
(CH3COO)2Pb, 5 %	1	1
Кипятить до появления окрашивания
Наблюдение окрашивания

Работа 2 Реакции осаждения белков

Реакции осаждения белков могут быть обратимыми и необратимыми. В первом случае белки не подвергаются глубоким изменениям, поэтому по­лучаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном раствори­теле с сохранением своих нативных свойств. При необратимых реакциях осажденные белки подвергаются глубоким изменениям – денатурации.

Реакции осаждения дают возможность:

1) изучить свойства бел­ков;

2) освободить жидкость от присутствия белка;

3) установить на­личие белка в биологических жидкостях, например в моче;

4) выса­ливанием с помощью различных концентраций нейтральных солей или спиртом выделить отдельные белковые фракции.

Реакция высаливания (осаждения белков с помощью высоких концентраций нейтральных солей) обусловлена дегидратацией мак­ромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация одних и тех же солей. Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины – в насыщенном растворе сернокислого аммония.

Осаждение белков солями тяжелых металлов (в отличие от выса­ливания) происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и ком­плексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исклю­чением солей AgNO₃, HgCl₂), но не растворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатура­цию.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатура­цию белка. Выпадение белка в виде осадка связано с денатурацией белковых частиц и образованием комплексных солей белка с кисло­тами. Ортофосфорная кислота (H₃PO₄) осадка не дает. В избытке всех мине­ральных кислот, за исключением азотной (HNO₃), выпавший в осадок белок растворяется.

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение бел­ков, чаще используют растворы трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот. Кро­ме белков она осаждает также продукты их распада — высокомолеку­лярные пептоны и полипептиды. Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков.

В органических растворителях (этанол, ацетон и др.) белки не рас­творяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Этанол свя­зывает воду, вызывая дегидратацию мицелл белка и неустойчивость их в растворе. При осаждении этанолом раствор белка должен быть нейт­ральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция облегчается при­сутствием электролита хлористого натрия вследствие снятия заряда с частиц белка. Реакция осаждения белка этанолом или кратковремен­ным действием этанола обратима при охлаждении. Если осадок быстро отделить от этанола, то белок может сохранить нативное состояние.

Осаждение белков алкалоидными реактивами также относится к необратимым реакциям. К группе алкалоидных реактивов принад­лежат танин, пикриновая кислота и др. Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами связан с образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотсодержащими группами белка. Белки – протамины и гистоны, несущие положительный за­ряд, хорошо осаждаются алкалоидными реактивами в нейтральной среде без подкисления.

Исследуемый материал: раствор яичного белка (способ приготовления дан в приложении).

Оборудование: градуированная пипетка объемом 1 и 5 мл, пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 15 шт., стеклянные палочки, спиртовка, воронка, фильтровальная бумага, штатив для пробирок, пробиркодержатель.

Реактивы: 1) 1 % раствор СН₃СООН; 2) 10 % раствор NaOH; 3) NaCl (порошок); 4) насыщенный раствор NaCl; 5) (NH₄)₂SO₄ (порошок); 6) насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄; 7) 10% раствор CuSO₄; 8) 5 % раствор (CH₃COO)₂Pb; 9) HNO₃ (конц.), H₂SO₄ (конц.); 10) 10 % раствор трихлоруксусной кислоты; 11) 20 % раствор сульфосалициловой кислоты; 12) насыщенный раствор пикриновой кислоты, дистиллированная вода.