2.2. Способы регенерации кофактора.

Из литературы известно несколько способов регенерации кофактора: биологический, ферментативный, электрохимический, химический и фотохимический. Все они имеют ряд преимуществ и недостатков. Рассмотрим их более подробно:

Преимущества биологического способа являются его высокая селективность и дешевизна используемых реагентов. С другой стороны, в некоторых системах происходит снижение энантиомерной чистоты продукта, возникает сложность в контролировании относительной активности ферментов. Кроме того, возможна несовместимость с некоторыми химическими и биохимическими компонентами [3].

Ферментативный способ имеет высокую селективность, особенно относительно NAD(P)->NAD(P)H. Он совместим с ферментативно катализируемыми системами синтеза. В случае этого способа достаточно просто осуществить мониторинг процесса реакции. Недостатками данного метода является высокая цена и низкая стабильность фермента. Поэтому работы по повышению операционной и температурной стабильности ферментов, используемых для регенерации кофактора являются весьма актуальными в настоящее время [3].

К преимуществам электрохимического метода можно отнести низкую себестоимость процесса электричества, простоту выделения продукта. К сожалению, этот способ является низкоселективным (особенно для восстановительной регенерации). Также недостатком является быстрое загрязнение электродов. В некоторых случаях требуется добавление ферментов [3].

Химический метод очень выгоден. Реагенты коммерчески доступны. Не требуется добавление ферментов. Минусы метода: сложность выделения продукта, небольшие выходы, низкая скорость процесса (особенно для окислительной регенерации). [3]

Фотохимический способ не требует добавления ферментов, но часто несовместим с биохимическими системами, также необходимы фотосенсибилизаторы (природные или искусственно синтезированные вещества, способные переносить энергию возбуждения светом другим молекулам). [3]

В настоящее время широко применяется ферментативный метод. Он может быть разделен на две группы. К первой группе относится способ, в котором один и тот же фермент катализирует как основную реакцию, так и реакцию регенерации кофактора. Ко второй группе относится способ, при котором в системе находятся два фермента, один из которых катализирует восстановление кофактора.

2.3. Ферменты, использующиеся для регенерации кофактора

2.3.1. Формиатдегидрогеназа

NAD⁺-зависимые формиатдегидрогеназы относятся к группе ферментов, катализирующих окисление формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD⁺ до NADH:

HCOO^- + NAD⁺ → CO₂↑ + NADH.

На основании различий в структуре можно выделить две большие группы ФДГ. В первую группу входят формиатдегидрогеназы из анаэробных микроорганизмов и архебактерий. ФДГ этой группы представляют собой гетероолигомеры со сложной четвертичной структурой и высокой молекулярной массой. Для них характерны наличие в активном центре различных простетических групп (железосерные кластеры, ионы молибдена, вольфрама) и высокая чувствительность к кислороду. [4,5]

Вторую группу образуют NAD⁺-зависимые формиатдегидрогеназы, которые состоят из двух идентичных субъединиц, имеют на молекулу по два активных центра и не содержат в белковой глобуле ни ионов металлов, ни простетических групп. ФДГ этой группы принадлежат к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2‑оксикислот [6]. Реакция окисления формиата, катализируемая ФДГ этой группы, является простейшим примером дегидрирования карбонильных соединений, так как в каталитическом механизме отсутствует стадия переноса протона(ов), а также какие-либо другие стадии кислотно-основного катализа. Скорость реакции в целом ограничивается скоростью переноса гидрид-иона от субстрата на атом С-4 никотинамидного кольца [7]. Таким образом, ФДГ служит модельным ферментом для изучения механизма переноса гидрид-иона в активном центре дегидрогеназ, входящих в данное суперсемейство. Простота и практическая необратимость формиатдегидрогеназной реакции, а также дешевизна второго субстрата-формиата делает этот фермент перспективным биокатализатором для регенерации NAD(P)H.

Основные свойства формиатдегидрогеназ из различных источников

Формиатдегидрогеназа содержится в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах, а также растениях. В настоящее время изучено большое количество природных FDH, а также получены штаммы-продуценты рекомбинантных формиатдегидрогеназ. Практически все FDH обладает широким pH-оптимумом (6-9). Km по формиату варьируется от 3 до 15 мкМ, по NAD⁺ - от 35 до 80 мкМ для бактериальных ферментов [8], для растительных FDH эта величина может достигать 6 мкМ [9]. Температурный оптимум – в пределах до 65°С. [8]

Преимущества FDH при использовании в процессах регенерации кофактора

Реакция окисления формиат-иона является необратимой, продуктом является углекислый газ, который можно легко вывести из сферы реакции. Также FDH обладает широким pH-оптимумом активности. Реакции, катализируемые FDH, являются высоко стереоспецифичными, что позволяет достичь выхода реакции 100%. Проведенные исследования и мутации позволили получить FDH, способные восстанавливать не только NADH, но и NADPH.