Практична робота № 9 Визначення титру мікробіологічних препаратів та ефективності їх застосування.

Мета заняття. Придбання практичних навиків при роботі з мікробіологічними препаратами.

Устаткування і матеріали. Мікроскоп МБР–1, мікроздрібнювач РТ–2, камера Горяєва, колби на 1000 мл, пробірки в штативах, чашки Петрі, мірні піпетки на 10 і 1 мл, скляні палички, посівні голки, спиртівки, предметні та покривні стекла. Зразки бактеріальних препаратів (ентобактерину, дендробациліну, бітоксібациліну тощо).

Завдання 1. Визначення титру мікробіологічних препаратів.

Титр бактеріальних препаратів визначають переведенням сухого порошку в суспензію. Для цього середню пробу препарату (1 г) зважують з точністю 0,001 г, вміщують у колбу мікроподрібнювача РТ–2 і наливають 50 мл 0,5%-го водного розчину жовчі. Суміш перемішують 2 хв при частоті обертання 3000 об/хв і доводять її об'єм до 100 мл. Концентрація препарату в ній становитиме 0,01 г/мл (1∙10^-2). Потім у штативі розміщують 8–10 пробірок з 9 мл стерильної води та піпетками. Стерильною піпеткою переносять 1 мл суспензії з колби мікроподрібнювача у першу пробірку, вміст перемішують другою стерильною піпеткою і з її допомогою переносять 1 мл суспензії у наступну пробірку. Послідовними розведеннями доводять концентрацію спор до 10^-8 в 1 мл (паралельно готують дві такі серії розведення). Далі в кожній серії готують 3–5 стерильних чашок Петрі для кожного розведення і посіву на стерильне живильне середовище, наприклад, м'ясо-пептонний агар чи ін. Для посіву беруть 1 мл суспензії такого розведення, щоб забезпечити ріст не більше 300 і не менше 50 колоній в одній чашці Петрі. Наприклад, при титрі препарату 30 млрд. спор/1 г розведення має становити 300.

Під час посіву стерильною піпеткою переносять по 1 мл суспензії на середину 5-ти стерильних чашок Петрі з двох паралельних розведень. Наливають розплавлене і охолоджене живильне середовище, ретельно перемішують його з суспензією, роблячи чашками кругові рухи на поверхні стола. Після затвердіння середовища чашки ставлять у термостат в перевернутому стані на добу при температурі 28–30°С. Потім підраховують колонії бактерій, які проросли.

Титр визначають за формулою:

Х=N_s/К,

де N_s – середньоарифметична кількість колоній з двох серій паралельних розведень;

К – розведення (у нашому випадку 1∙10^-8).

Завдання 2. Визначення ефективності бактеріальних препаратів.

2.1 Визначення ефективності препарату в лабораторних умовах.

1. З цією метою, навесні, відірвані листки рослин, якими живляться фітофаги певного виду, розміщують в один шар на площі 1 м² і на них наносять з пульверизатора 50 мл 0,5% суспензії досліджуваного біопрепарату, що відповідає виробничій витраті робочої суспензії 500 л/га. Для порівняння досліджують партію препарату, виготовлену в поточному році. Паралельно інші листки обприскують звичайною водою (контроль). Оброблені листки з комахами, які ними живляться, після підсихання вміщують у садки. Листки замінюють в міру підсихання. Загибель комах обліковують через 5, 10 і 15 діб. Висновки роблять на підставі 10-денних результатів.

2. Для порівняльної оцінки ефективності препаратів визначають ЛD₅₀, тобто концентрацію препарату, що викликає 50% смертність комах. Як тест-об’єкт використовують гусінь капустяної білянки, капустяної молі або листогризучих гусениць плодових (ягідних культур), які наявні в достатній кількості на дослідних ділянках, і де можна провести випробування препарату в польових умовах. При цьому підбирають гусениць одного віку.

Для оцінки ефективності готують серію концентрацій препарату, при високих значеннях яких забезпечується 100% смертність комах, наприклад, 5; 3; 1; 0,5; 0,1; 0,01 і 0,001% у відношенні до готового препарату промислового виготовлення. На кружечок листової пластинки площею 1 см² наносять по 0,01 мл суспензії різних концентрацій препарату. Кружечок з однією гусеницею вкладають в чашку Петрі або пробірку для індивідуального вигодовування. Для кожної концентрації препарату готують по 10 чашок (пробірок) у 3-кратній повторності.

При підсиханні, корм для комах міняють на свіжий, але без додаткової обробки біопрепаратом. Після загибелі гусениць, вибірково проводять мікробіологічний аналіз в досліді та в контролі з метою встановлення причин загибелі гусениць, зокрема від наявності латентної інфекції інших патогенних мікроорганізмів — вірусів, мікроспоридій і ін. Через 5–6 днів після обробки дослід закінчують і визначають середній відсоток загибелі комах, який характеризує біологічну (технічну) активність препарату, для кожної концентрації препарату з поправкою на смертність в контролі згідно формули:

(5.1)

де М₀ – загибель комах у досліді внаслідок дії на них біопрепарату, в середньому;

M_k — загибель комах в контролі.

2.2. Визначення ефективності препарату в польових умовах. У цьому досліді число варіантів залежить від числа препаратів, що вивчаються, або його препаративних форм, але в схему досліду обов'язково вводять контроль (обприскування водою) і еталон. За еталон використовують препарат, який рекомендується для культури і шкідника (інсектицид з відповідною нормою витрати). Суспензію бактеріального препарату готують не раніше чим за 2 год до початку обробки. Обприскування проводять рано вранці або ввечері при теплій і сухій погоді після переходу шкідника до відкритого живлення.

Для визначення біологічної (технічної) ефективності біологічних препаратів облік чисельності шкідників (пошкодженість рослин) проводять до обробки та через 3; 5; 10 і 15 днів після обробки відповідно до методики, яка передбачена для даної культури (кількість живих комах на 1 м² або на 1 качан капусти, на 0,5 м гілки тощо). Біологічну ефективність розраховують згідно формул 5.2 –5.4.

Найчастіше для розрахунків використовується формула 5.2:

(5.2),

де С – технічна ефективність,

А – чисельність шкідника, або заселених ним рослин до обробки,

В – чисельність шкідника, або заселених ним рослин після обробки.

Якщо шкідник вільно живиться і мігрує (білани, листогризучі совки, лучний метелик), то біологічну ефективність визначають за формулою:

(5.3),

де С – технічна ефективність;

К₁, К₂ – чисельність шкідника на контрольній ділянці відповідно до і після обробки пестицидом дослідної ділянки;

D₁ та D₂ – чисельність шкідника на дослідній ділянці відповідно до і після обробки.

Технічну ефективність інколи оцінюють за ступенем пошкодження рослин або урожаю (плодів, зерна, коренеплодів тощо) за формулою:

(5.4),

де С – технічна ефективність;

a, b – пошкодження рослин (урожаю) на контрольній і дослідній ділянках, відповідно.

Інформаційний матеріал

В Україні якість мікробіологічних препаратів характеризують їх титром та біологічною (технічною) активністю. При випробуванні ефективності і застосуванні препаратів важливо стежити за тим, щоб титр його робочої суспензії відповідав рекомендованим показникам. Особливо важливо контролювати титр препарату при його виготовленні малими партіями в умовах виробничих біолабораторій станцій захисту рослин.

Титр – це кількість життєздатних спор, поліедрів, гранул в 1 мл або 1 г препарату,

Біологічна (технічна) активність – показник, який відображає загибель комах при впливі на них певних доз препарату.

Застосування грибних препаратів провадять за діючою речовиною (спори) в умовних кілограмах; умовний кілограм препарату — це розрахункова одиниця, яка містить задану кількість спор без обліку фактичної, фізичної маси товарного препарату; кількість діючого речовини (спор) в одному умовному кілограмі препарату; вертицилій – 2∙10¹² (2∙10⁹ спор/г); ашерсонія – 6∙10¹² (6∙10⁹ спор/г); боверин – 2∙10¹² (2∙10⁹ спор/г).