Тема Тс16. Одержання бар з культур мікроорганізмів
Культура мікроорганізмів, вирощена поверхневим способом, і культуральна рідина після глибинного культивування містять велику кількість баластових речовин. Виділення й очищення БАР - трудомісткий і дорогий процес тому, якщо препарат можна використати у вигляді неочищеної культури мікроорганізмів, його очищення не проводять.
Вихідним матеріалом для одержання очищених біологічноактивних препаратів може служити фільтрат культуральної рідини, рідше - біомаса продуцента або водний екстракт із поверхневої культури продуцента. Препарати можуть бути отримані у вигляді порошків або рідких концентратів. У процесі виділення відбувається підвищення частки активного білку в загальній масі препарату, тобто збільшується його питома активність.
16.1 Принципова схема одержання бар
Схема очищення від баластових речовин зводиться до звільнення від нерозчинних речовин. Процеси одержання очищених препаратів з поверхневих і глибинних культур трохи різні. З поверхневих культур сутужніше одержати високоочищені препарати через велику кількість баластових речовин. Із глибинних культур одержати очищені препарати трохи легше, але при цьому доводиться вести виділення з розведених розчинів, якщо виділення БАР проводиться з рідкої частини культури. Виділення ускладнюється, якщо речовина внутрішньоклітинна, і тоді необхідно руйнувати клітини мікроорганізмів.
Принципову схему виділення й очищення ферментів із глибинних і поверхневих культур мікроорганізмів можна представити у вигляді наступної схеми (рис16.1) .
Рисунок 16.1 - Принципова схема одержання БАР
Зі схеми ясно, що екстракт із поверхневої культури або фільтрат культуральної рідини є вихідним матеріалом для одержання препаратів різного ступеня очищення. На першому етапі виділення відходом процесу є нерозчинна частина культури - біошрот, що містить нерозчинні включення середовища й біомасу продуцента.
Далі залежно від властивостей виділюваної речовини й супутнього йому баласту схема очищення й одержання препарату може включати різні прийоми й методи, такі, як концентрування, діаліз, осадження органічними розчинниками, солями, гель-фільтрування, афінна хроматографія, іммобілізація, сушіння термолабільних матеріалів і т.д. Тому розглянемо етапи одержання БАР.
16.2 Одержання неочищених препаратів
Неочищені препарати являють собою культуру мікроорганізму разом із залишками поживного середовища висушену при м'якому режимі до вологості не більше 8-12%.
Неочищений препарат може бути отриманий на основі поверхневої або глибинної культури. Глибинна культура може бути перед сушінням очищена від нерозчинної частини (тверда суспензія середовища й біомаси продуцента) або висушена разом з нею.
Одержання сухої поверхневої культури. Поверхнева культура мікроорганізму має вологість від 35 до 58%. Це низькостабільний продукт, який потрібно або негайно пускати у виробництво, або висушувати до рівноважної вологості (10-12 %). Для висушування культура, вивантажена з ростильної камери, подрібнюється до певної величини й далі надходить на висушування.
Для сушіння культури мікроорганізму можуть бути використані стрічкові, тунельні, шахтні, барабанні, шафові й вібраційні сушарки. Порівняно часто для сушіння культур мікроорганізмів використовують барабанні сушарки прямоточного типу. Волога культура надходить у сушарку одночасно з теплоносієм, що має температуру 80—85°С. Таку високу температуру припустимо застосовувати тому, що висушуваний матеріал, містить велику кількість вологи, а при її випарюванні частки культури майже не нагріваються, і активність ферментів зберігається майже повністю. У більшості барабанних сушарок на внутрішній поверхні є насадка у вигляді лопаток або хрестовини. Барабан обертається повільно із частотою від 3 до 8 хв-1. Матеріал, що висушується, за допомогою лопаток піднімається, пересипається й пересувається уздовж барабана. Відбувається деяка диференціація часток культури по розмірах — більші частки падають майже вертикально вниз і знову підхоплюються лопатками, а дрібні підхоплюються теплоносієм, траєкторія їхнього падіння трохи зміщається, і вони швидше переміщаються по барабані. Тому висушений у такій сушарці продукт має рівномірну вологість по всій масі. Тривалість перебування висушуваної частки, у сушарці 3-7 хв, швидкість руху подаваного теплоносія 2-3 м/с, температура повітря на вході 80—85°С, на виході 60—65°С, температура висушеного матеріалу 40 °С. Втрати активності в процесі сушіння становлять 3-10%.
Інший вид сушарок, використовуваний для сушіння культур, - це парові конвеєрні сушарки, які представляють собою герметизований стрічковий конвеєр. При сушінні в таких установках втрати активності більші, але вони дуже компактні й мають більшу продуктивність.
Для висушування поверхневої культури можна використати всілякі конструкції сушарок, у яких тривалість перебування культури скорочена до 5—8 хв при температурі продукту на виході не вище 40—42 °С, що дозволяє звести до мінімуму втрати активності.
Готову суху культуру звичайно впаковують на спеціальній фасувальній машині по 25-40 кг, мішки зашивають на зашивочній машині й відправляють на склад готової продукції.
Очищення культуральної рідини від твердих суспензій. Частина продуцентів накопичує основну частину синтезованих ними БАР у поживному середовищі. При одержанні очищених препаратів нерозчинну частину середовища разом з біомасою продуцента відокремлюють на фільтрах, центрифугах або сепараторах.
Найбільше широко в мікробіологічній промисловості використовують комірковий барабанний вакуум-фільтр безперервної дії із зовнішньою поверхнею фільтрування. Схема роботи такого фільтра представлена на рис. 16.2. Ці фільтри мають високий ступінь механізації й дозволяють здійснювати фільтрування різних суспензій з постійною швидкістю. Барабанні вакуум-фільтри являють собою барабан, занурений у ємність, у яку безупинно подається культуральна рідина. Поверхня барабана перфорована й обтягнута фільтруючою тканиною (батист або інша синтетична тканина аналогічного типу).
1 – барабан; 2 – секціонована поверхня барабана; 3 – фільтруюча тканина; 4 – секційні продольні перегородки; 5 – ніж; 6 – підсушений осад; 7 – ємність з культуральною рідиною; 8 – зливна труба, 9 – форсунки для промивання осаду.
І – зона фільтрації; ІІ – зона підсушування; ІІІ – зона промивання; ІV – зона підсушування; V – зона віддувши.
Рисунок 16.2 – Схема роботи барабанного вакуум-фільтра:
1 – фільтруюча тканина або пластина; 2 – секція для вихідної культуральної рідини; 3 – секція для збирання фільтрату культуральної рідини; 4 – відвід фільтрату; 5 – підвід культуральної рідини.
Рисунок 16.3 - Схема роботи рамного прес-фільтра
Іноді при наявності в культуральній рідині важко відокремлюваних осадів з високими питомими опорами в якості фільтруючої поверхні використовують намивний шар. Знімання осаду на цих фільтрах здійснюється спеціальним ножем. При кожному обороті барабана разом з осадом видаляється частина намивного шару й фільтруюча поверхня обновляється. Барабан обертається повільно із частотою 0,13 – 0,26 хв-1 і проходить послідовно зони фільтрування, підсушування, промивання осаду, підсушування й віддувки. Барабан розділений на секції за допомогою нерухомої розподільної голівки, що складає з декількох камер, які з'єднані відповідно з вакуум-приймачами фільтрату й промивних вод, а також з лінією стисненого повітря.
Барабанні фільтри зручні для відділення не тільки біомаси продуцента, але й нерозчинних суспензій, яких порівняно багато в середовищі (вижимки, висівки, макуха, ростки й т.д.). До недоліків фільтрів цього типу можна віднести їх порівняно низьку продуктивність, громіздкість (відношення питомої поверхні фільтрування до обсягу фільтрату невелика) і неможливість забезпечення асептичних умов.
У ферментній промисловості рідше використають рамні фільтрпреси періодичної дії з ручним вивантаженням осаду (рис. 16.3). З їхньою допомогою можна одержувати прозорі фільтрати, але ці фільтри працюють періодично без регенерації фільтруючої поверхні. Оскільки шламовий простір обмежений, а шар осаду до кінця фільтрування досягає значної товщини, то швидкість фільтрування падає, незважаючи на підвищення робочого тиску. При заповненні шламового простору осадом фільтрпрес відключають, розбирають і промивають або змінюють фільтруюче полотно. Продуктивність фільтрпреса набагато менше, ніж барабанного вакуум-фільтра, вона лімітується вмістом осаду у фільтруємій рідині й обсягом рамного простору фільтрпреса. Процес фільтрування в рамному фільтрі ведеться під тиском 0,6-0,4 МПа. Культуральна рідина через отвори в стінці рами надходить у внутрішню порожнину фільтруючого елемента, суспензія затримується на фільтруючих поверхнях, а фільтрат проходить через фільтруючу серветку й стікає по канавках у плитах у трубопровід. Звичайно перші порції фільтрату бувають мутні і їх повторно фільтрують.
Рисунок 16.4 – Схема автоматизованого фільтрпреса ФПАКМ
Недоліки фільтрпреса в значній мірі усунуті в конструкції з горизонтальними камерами типу ФПАКМ (рис. 16.4). Він складається з ряду розташованих одна над іншою горизонтальних фільтрувальних плит 2, між якими натягнута фільтрувальна тканина 4. Фільтрувальні плити розміщені між верхньою й нижньою підтримуючими плитами 1, а фільтрувальна тканина натягнута на напрямні ролики 3. Цикл роботи фільтрпреса складається зі стиснення плит, фільтрування, промивання й зневоднювання осаду, розсовування плит і розвантаження осаду одночасно з переміщенням тканини і її промиванням. Робота фільтрпреса ФПАКМ повністю автоматизована. Ці фільтри мають розвинену фільтруючу поверхню (на 8 м2 площі, займаною установкою, доводиться до 25 м2 фільтруючої поверхні); осад віджимається під тиском 0,8–1,5 МПа й має вологість не більше 60—70%; порівняно невеликі енерговитрати (0,8–1 кВт∙год на 1 м2 фільтруючої поверхні); питома продуктивність його в 6–8 разів вище, ніж в інших фільтрпресів [при концентрації твердої фази в суспензії 4–7 г/л 1000 л/(м2∙ч)]; втрати активності не перевищують 4–5 %. Установки ФПАКМ випускаються із площею фільтруючої поверхні від 2,5 до 50 м2. Їхнє застосування для очищення ферментних розчинів дуже перспективно; особливо цей тип фільтрів рекомендується для фільтрування суспензії культуральної рідини бактерій.
До фільтрів, що працюють під тиском, відносяться різні конструкції листових фільтрів. Загальним для фільтрів цього типу є наявність плоских фільтрувальних елементів із твердим каркасом. Осад з фільтруючої поверхні може видалятися різними способами: стисненим повітрям, парою, вібрацією, під дією відцентрової сили.
Деякі бактеріальні культури навіть при використанні допоміжних фільтруючих матеріалів фільтруються зі швидкістю нижче 30 л/(м2∙год). У цих випадках для відділення біомаси й видалення суспензії широко застосовуються відцентрові сепаратори. У ферментній промисловості застосовуються сепаратори-кларифікатори типу ВСМ, що представляють собою ємність 4, усередині якої розташовується барабан (рис. 16.5). Усередині барабана перебувають концентричні циліндри-вставки 3. Розчин, що очищається, по патрубку 1 надходить у циліндр із найменшим радіусом, потім проходить уздовж встановлених циліндрів, щоразу міняючи напрямок. Прояснена рідина видаляється з барабана за допомогою напірного диска 2 під тиском, а осад під дією відцентрової сили відкидається до внутрішньої стінки циліндричних вставок. Продуктивність сепараторів цього виду може досягати до 2000-5000 л/год.
Рисунок 16.5 – Схема сепаратора-кларифікатора типу ВСМ
У виробництві БАР використовуються різні типи й конструкції саморозвантажних сепараторів. Застосовують сепаратори типів АСЕ-3, АСІ, АСЕ-Б з відцентровим пульсуючим вивантаженням осаду, що мають відповідно продуктивність 500, 1500 й 2000 л/год, при діаметрі барабана 600 мм і міжтарілчастому зазорі 0,5 мм. На підприємствах дуже великої продуктивності використовуються так названі соплові сепаратори фірми «Альфа-Лаваль» (Швеція) типів QX й FEUX продуктивністю від 80 до 200 м3/ч.
Ефективність відділення біомаси багато в чому залежить не тільки від типів використовуваних апаратів, але й від складу середовища, розмірів відокремлюваних часток, кількості нерозчинної фракції, фізико-хімічних характеристик фільтруючих матеріалів, температурних режимів і т.д. Для поліпшення процесу фільтрування проводять попередню хімічну обробку культуральної рідини. Для цього культуральну рідину підлужують до рН 8-8,5 і вводять 0,1%-вий розчин хлористого кальцію, у результаті утвориться гель фосфату кальцію, що сприяє найбільш повному відділенню осаду при найменших втратах. Але попередня хімічна обробка не завжди дає гарні результати, тому для підвищення ефективності процесу часто використовують різні кізельгури, наприклад, діатоміт і радіоліт (Японія), мікрозіл (Франція), діатоміт (Бельгія), кларгель (Великобританія) і т.д. Використання цих наповнювачів може різко підвищити швидкість фільтрування, але разом із цим збільшуються втрати активності на цій технологічній стадії.
Отриману біомасу продуцента разом з нерозчинними частками середовища (біошрот) при необхідності стерилізують, висушують і використають на корм твариною. Фільтрат культуральної рідини нестабільний, він не може зберігатися й повинен негайно направлятися на подальшу обробку для одержання очищених препаратів.
У процесі культивування в інокуляторах і ферментаторі зростаюча культура аерується кондиціонованим стерильним повітрям. Стиснуте у компресорі й нагріте від 80 до 220°С повітря після видалення конденсаційної вологи надходить у головний фільтр 11, заповнений скловатою. Далі очищене повітря надходить в індивідуальні фільтри тонкого очищення 13, 15, 17, 20, 26 і подається для охолодження піногасника й аерації зростаючої культури в інокуляторах 16, 19 і ферментаторі 25. Повітря, що відходить, з інокуляторів і ферментатора перед викидом в атмосферу очищається у фільтрах 18, 21 и 27.
Готова культуральна рідина насосом 30 або самоплином при перемішуванні надходить у теплообмінник 28 для охолодження перед надходженням у збірник 29. Необхідність охолодження викликана тим, що відразу всю культуральну рідину обробити неможливо, а при тривалому зберіганні в збірнику може відбутися інактивація БАР. Зі збірника 29 охолоджена рідина в міру необхідності подається на фільтрувальну установку.
Контрольні питання до теми Т16
1. Наведіть принципову схема одержання БАР.
2. Одержання неочищених препаратів.
3. Як відбувається очищення культуральної рідини від твердих суспензій?