1.Метод мембранной фильтрации

2.Метод прямого посева

Питательные среды : тиогликолевая, Сабуро

Инкубация – до 14 суток

Анализ пирогенности

Пирогенные вещества-Погибшие м/о, остаки м/о, бактериальные эндотоксины (липополисахарид,ы) длинная цепь жирной кислоты (липид А), + сахарная цепь + вариабельная углеводная цепочка (О-антиген).

Бывают- экзогенные и эндогенные (нейтрофильные лейкоциты, моноциты и другие подвижные и фиксированные макрофаги )

Источники эндотоксинов

• вода, (растворитель или для обработки);

• ампулы и флаконы;

• химические вещества и специально необработанные материалы;

• воздух;

• персонал

Легкая степень – температура тела повышается в пределах 1 0С, возникают головная боль, боли в мышцах.

Средняя тяжесть – озноб, повышение температуры тела на 1,5-2 0С, учащение пульса и дыхания.

Тяжелая реакция – потрясающий озноб, температура повышается более чем на 2 0С, достигая 40 0С и более, выраженная головная боль, боли в мышцах, костях, одышка, цианоз губ, тахикардия.

Пироген связывается с белками к СD14-рецепторам лейкоцитов (особенно моноцитов и макрофагов), эндотелиальными и другими типами клеток (липополисахарид-связывающий белковый комплекс).

Активированные липополисахарид-связывающим белковым комплексом, мононуклеарные фагоциты продуцируют фактор некроза опухоли, который в свою очередь индуцирует синтез интерлейкина-1 → действие на эндотелиальные клетки, продуцирующие интерлейкин-6, интерлейкин-8 и адгезивные молекулы.

Первичное высвобождение эндотоксина приводит к ЦИТОКИНОВОМУ КАСКАДУ, который активирует высвобождение провоспалительных цитокинов макрофагов и повышает эндотелиальную адгезию молекул для лейкоцитов, усиливая комплемент-опосредованную реакцию нейтрофилов Высокие уровни липополисахарида приводят к повреждению эндотелиальных клеток, которое даёт начало коагуляционному каскаду

При длительном избытке эндотоксина цитокиновый каскад усиливает синтез вторичных эффекторов - оксида азота (NO) и фактора активации тромбоцитов. Эндокринные и паракринные эффекты цитокинов и вторичных медиаторов приводят к системной вазодилатации и гипотензии, снижению сердечной сократимости, гиперактивации системы коагуляции, повреждению и активации эндотелия, системной адгезии лейкоцитов.

Системная вазодилатация и снижение сердечной сократимости - снижение перфузии и гипоксия.

На фоне повреждение эндотелия, прогрессирование активации системы коагуляции и повышение проницаемости капилляров реализуются в : - септический шок; - полиорганная недостаточность; - ДВС-синдром; - респираторный дистресс синдром взрослых.

Контроль-биологический метод на кроликах (ГФ XI) — с 1940 г.

ПИРОГЕННОСТЬ (ОФС 42-0061-07)

Первый этап - полученный результат меньше или равен 1,2 ºС

Второй этап - полученный результат меньше или равен 2,8 ºС

Этап	Общее количество животных	Оценка результатов испытания (DSt)
		Лекарственное средство признают апирогенным		Повторное испытание (перестановку) проводят		Лекарственное средство признают пирогенным, если DSt
		если S Dt	при числе животных с повышением Dt > 0,5 оС не более	если DSt	при числе животных с повышением Dt > 0,5 оС
I	3	£ 1,2	—	> 1,2	³ 1	—
II	6	£ 2,8	1	> 2,8, но < 4,3	> 1	> 4,3
III	9	£ 4,5	2	> 4,5, но < 6,0	> 2	> 6,0
IV	12	£ 6,6	3	—	—	> 6,6*

повышение температуры:

• у человека возникает при внутривенном введении 0,3 ЭЕ/кг (4–8 ЭЕ/кг),

• у кролика — 10–15 ЭЕ/кг.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ

(ОФС 42-0062-07)

LAL-тест «Limulus Amebocite Lisate» - лизат амебоцитов мечехвоста

ТАL-тест Tachypleus tridentatus (тахиплеус тризубый)

Пирогены (эндотоксины) активируют в лизате амебоцитов комплекс ферментов, изменяющий физико-химические свойства смеси

Возможности использования ЛАЛ-теста

• ненаркотические анальгетики, транквилизаторы, нейролептики, кортикостероиды и некоторые анестетики (т. е. препараты-антипиретики, вызывающие понижение температуры тела, и, следовательно, способные маскировать наличие пирогенов);

• препараты плаценты, вакцины, новокаин (т. е. препараты, вызывающие повышение температуры, обусловленное их фармакологическими свойствами);

• средства для наркоза, сердечные гликозиды, наркотические анальгетики, инсулин, адреналин, снотворные средства, деполяризующие миорелаксанты (т. е. препараты, которые в силу своих фармакологических свойств вызывают изменения физиологического состояния животных);

• инфузионные препараты, суточный объем введения которых превышает 700 мл;

• радиофармацевтические препараты;

• антибиотики, воздействуя на микрофлору, вызывают у кроликов дисбактериоз или, как в случае линкомицина гидрохлорида — кандидомикоз.

• постадийный контроль производства:

• контроль сырья;

• контроль воды для инъекций;

• проверка оборудования элементов фильтра на вымывание из них пирогенов;

• контроль растворов перед стерилизующим фильтрованием;

• контроль чистоты ампул, флаконов.

Реализация LAL-теста

• Гель-тромб тест (GLAL) (PyrotellR - Associates of Cape Cod, Inc) образование плотного геля на дне пробирки - контроль по переворачиванию

• Турбидиметрический LAL-тест (Pyrotell-TR - Associates of Cape Cod, Inc) чувствительность считывающего устройства LAL-5000 − от 0,001 ЕДэ/мл.

• Хромогенный LAL-тест (CLAL) (PyrochromeR - Associates of Cape Cod, Inc) Максимальная чувствительность - 0,005 ЕДэ/мл. (добавление хромогенного вещества, как более чувствительного индикатора эндотоксина, в присутствии которого LAL приобретает жёлтый цвет)

Апирогенная вода для LAL-теста - LAL-вода, предназначена для растворения LAL-реактива, приготовления растворов эндотоксина в разных концентрациях, разведения образцов, а также используется в качестве отрицательного контроля необходимо развести исходный препарат равным объемом раствора эндотоксина с концентрацией 4l.

Люминисцентный метод определения пирогенов (интенсивность люминесцентности красителя родамина 6Ж (анализатор биожидкостей флюоресцентнофотометрический с детекцией хроматографической Флюорат-02 АБФФ-ДХ).