Время, мин

Рис. 4.12. Типовой вид хроматограммы при определении аминокислотного состава краснокочанной капусты: 1 – лизин; 2 – гистидин; 3 – аммиак; 4 - аргинин; 5 – аспарагиновая кислота; 6 – треонин; 7 – серин; 8 – глутаминовая кислота; 9 – пролин; 10 – глицин; 11 – аланин; 12 – цистин; 13 – валин; 14 – метионин; 15 – изолейцин; 16 – лейцин; 17 – тирозин; 18 – фенилаланин; 19 – γ-аминомасляная кислота

При проведении количественного анализа определяют площадь пика S_i для i-аминокислоты (i = 1–19) по формуле (4.5):

S_i = h_i · b_i ,

где h_i – высота пика по i-аминокислоте;

b_i – ширина пика по i-аминокислоте на половине его высоты.

Затем рассчитывают содержание (X_i, %) i-аминокислоты в анализируемой пробе по формуле:

, (4.24)

Для определения же количества аминокислот в абсолютных единицах строят градуировочный график по стандарту (лейцину) [5].

4.4. Гель-хроматография

Различие в размерах молекул анализируемого продукта используется в ме-тоде гель-фильтрации (гель-хроматографии).

При этом как подвижную, так и неподвижную фазу составляет раствори-тель; во втором случае растворитель находится в порах геля.

Порядок разделения:

– с колонки вымываются самые большие молекулы;

– молекулы меньшего размера, способные диффундировать в поры матри-цы, заполненные жидкой фазой, удерживаются на колонке.

Диапазон молекулярных масс макромолекул, способных проникать в час-тицы геля и выходить из них, определяется размером пор матрицы геля.

На практике применяют гели, которые подразделяются на три основные группы:

1. Мягкие гели – высокомолекулярные соединения с незначительным чис-лом поперечных связей (крахмал, декстрины), которые используют лишь для разделения низкомолекулярных веществ.

2. Полужесткие – продукты сополимеризации (например, стирола и диви-нилбензола) с большим числом поперечных связей.

3. Жесткие – силикагели и пористые стекла.

Гель-хроматографию часто используют для преперативного разделения белков. При этом анализ смеси белков неизвестного состава проводят в следую-щем порядке:

– используют гелевую матрицу с широким диапазоном фракционирования;

– собирают анализируемую белковую фракцию и разделяют ее на геле с более узким диапазоном фракционирования.

Рис. 4.13. Зависимость коэффициента распределения (κ_d) белка в порах геля от его молекулярной массы (M)

Количественная оценка проводится следующим образом.

Коэффициент распределения (κ_d) для стандартного белка с известной молекулярной массой (M) можно использовать для оценки молекулярной массы белков, имеющих подобную форму. Так, J. Porath в 1963 г. установил, что су-ществует зависимость между и M^1/2, имеющая, как видно из рис. 4.13, ли-нейный характер:

A · M^1/2, (4.25)

где А – коэффициент пропорциональности.

Уравнение (4.25) основано на предположениях:

– поры геля имеют различную форму (сферическую, воронкообразную, щелеобразную);

– эффективным радиусом макромолекулы является радикс вращения.

Примечания

1. Оценка молекулярной массы производится для очищенных белков.

2. В случае статистического клубка (при анализе развернутых белков) для количественных расчетов используют зависимость:

, (5.18)

где В – коэффициент пропорциональности;

R_g – эффективный радиус вращения.

Весьма перспективным, с точки зрения чувствительности и точности, явля-ется также метод определения аминокислотного состава белка на хроматомасс-спектрометре, снабженном компьютером. Сочетание хроматографии и масс-спектрометрии позволяет решать подобные вопросы весьма изящно.